劉赟蕾，宮婷婷，王中新

近年來，侵襲性光滑念珠菌感染發(fā)病率不斷上升，光滑念珠菌對(duì)常規(guī)抗真菌藥物的耐藥情況愈加嚴(yán)重，且多重耐藥光滑念珠菌檢出率也明顯升高，給臨床抗真菌感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)。研究[1]表明，真菌耐藥性的產(chǎn)生歸因于基因突變，從點(diǎn)突變到整個(gè)染色體缺失、插入、重排等。DNA錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair,MMR)系統(tǒng)維持DNA復(fù)制的保真性，其廣泛存在于生物體中，該系統(tǒng)缺陷與基因突變率增加有關(guān)[2]。在人類基因組中，該系統(tǒng)缺陷與某些癌癥(如非息肉型結(jié)直腸癌)相關(guān)[2-3]；在細(xì)菌中，MMR系統(tǒng)缺陷是細(xì)菌獲得性耐藥性的重要機(jī)制[4]；在白色念珠菌中，MMR系統(tǒng)缺陷導(dǎo)致基因不穩(wěn)定性增加，更快獲得對(duì)氟康唑耐藥性[5]。MSH2基因?yàn)楹薓MR基因(屬M(fèi)MR系統(tǒng)基因的一種)，相關(guān)研究[1]表明MSH2基因突變?yōu)楣饣钪榫@得多重耐藥性的驅(qū)動(dòng)因素，且具有特定錯(cuò)義突變的菌株在體外表現(xiàn)出更高的耐藥性。該實(shí)驗(yàn)通過分析氟康唑敏感型、劑量依賴性敏感型(susceptible-dose dependent,S-DD)及耐藥型光滑念株菌中MSH2基因突變情況，旨在探討光滑念珠菌MSH2基因突變與氟康唑耐藥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株來源收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科2017年7月～2018年7月的門診及住院患者的痰、尿、血液或分泌物等標(biāo)本中分離獲得的光滑念珠菌，標(biāo)本源自同一患者同一住院時(shí)間段同一部位的重復(fù)菌株只納入一株分析，菌株保存在-80 ℃菌株庫。選取光滑念珠菌ATCC MYA-2950作為真菌鑒定的質(zhì)控菌株，白色念珠菌ATCC 10231作為真菌藥敏的質(zhì)控菌株，使用大腸桿菌ATCC 8739作為質(zhì)譜儀器的校準(zhǔn)菌株。

1.2 儀器和試劑酵母基因組DNA提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；DL 5 000 DNA Marker 和Premix Ex Taq 酶體系(日本TaKaRa公司)；RPMI1640液體培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；MOPS(北京索萊寶技術(shù)有限公司)；ATBFUNGUS3試劑盒、VITEK MS IVD (V2.0) 質(zhì)譜儀 (法國Biomérieux公司)；PCR儀(德國 Biometra公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；全自動(dòng)凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)等。

1.3 方法

1.3.1菌株鑒定 將菌株從-80 ℃菌株庫中取出，接種于科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)48 h初步鑒定，再用VITEK MS IVD (V2.0) 質(zhì)譜儀進(jìn)一步鑒定，以光滑念珠菌ATCC MYA-2950作為鑒定質(zhì)控菌株，質(zhì)譜儀器的校準(zhǔn)菌株大腸桿菌ATCC8739。

1.3.2藥敏試驗(yàn) 采用ATBFUNGUS3試劑盒進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，藥敏結(jié)果根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦折點(diǎn)判讀，以白色念珠菌ATCC 10231作為真菌藥敏的質(zhì)控菌株，隨機(jī)選取19株氟康唑耐藥菌株、15株氟康唑中介菌株和23株敏感菌株，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3制備DNA模板 將上述菌株從-80 ℃菌株庫中取出，接種于沙保弱培養(yǎng)基35 ℃培養(yǎng)48 h傳代2次進(jìn)行復(fù)蘇，挑取單個(gè)菌落于5 ml RPMI1640液體培養(yǎng)基，37 ℃、250 r/min震蕩培養(yǎng)16 h。取1 ml菌液離心收集菌體，按照酵母基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA，產(chǎn)物放于-20 ℃冰箱備用。

1.3.4擴(kuò)增MSH2基因及測(cè)序MSH2基因引物設(shè)計(jì)參照已有文獻(xiàn)[6]委托上海生工生物工程有限公司合成，使用3對(duì)引物33F/1188R、1013F/2170R、1914F/2985R 對(duì)MSH2基因分段擴(kuò)增，所得產(chǎn)物分別標(biāo)記為MSH2基因片段1、MSH2基因片段2、MSH2基因片段3，引物序列見表1。50 μl PCR反應(yīng)體系為5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μl，PrimeSTAR GXLDNAPolymerase 1 μl，dNTPMixture(各2.5 mmol/L ) 4 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，DNA模板(25 ng/μl)2 μl，滅菌雙蒸水31 μl。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用全自動(dòng)凝膠成像儀中觀察拍照。將PCR產(chǎn)物送至上海生工公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果應(yīng)用BLST軟件，與標(biāo)準(zhǔn)序列(KY110695.1-KY110696.1)進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 MSH2基因PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，3組實(shí)驗(yàn)菌株出現(xiàn)MSH2基因突變頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3組之間的兩兩比較以P<0.016 7為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光滑念珠菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)鑒定，共157株光滑念珠菌，對(duì)氟康唑等5種抗真菌藥物的藥敏分析結(jié)果見表2，同時(shí)存在唑類交叉耐藥及多藥耐藥現(xiàn)象。

表2 157株光滑念珠菌體外藥敏結(jié)果情況(%)

2.2MSH2基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果以隨機(jī)選取的57株研究菌株的DNA為模板，對(duì)MSH2基因分段行PCR擴(kuò)增，每株均獲得預(yù)期大小的片段。部分菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 MSH2基因分段PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

A:MSH2基因片段1；B:MSH2基因片段2；C:MSH2基因片段3；M：DNA Marker；P:陽性對(duì)照(已經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確認(rèn)為光滑念珠菌MSH2基因的DNA)；N:陰性對(duì)照；1～4：部分氟康唑耐藥菌株；9～12：部分S-DD菌株；17～20：部分敏感菌株

2.3MSH2基因測(cè)序結(jié)果目的基因測(cè)序結(jié)果與Genbank中MSH2基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行Blast分析比對(duì)，57株光滑念珠菌共檢測(cè)出3個(gè)非同義突變位點(diǎn)C622T/A2669T、G715T，分別對(duì)應(yīng)氨基酸置換位點(diǎn)為P208S/N890I、V239L。19株氟康唑耐藥菌株有17株發(fā)生MSH2基因突變，其中涉及C622T/ A2669T突變2株，涉及G715T突變15株，未發(fā)現(xiàn)3個(gè)非同義突變位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)在同一菌株；15株氟康唑S-DD菌株有13株發(fā)生MSH2基因突變，均只涉及G715T一個(gè)非同義突變位點(diǎn)；23株敏感菌株有10株發(fā)生MSH2基因突變，也均只涉及G715T一個(gè)非同義突變位點(diǎn)。見表3。

設(shè)α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，氟康唑耐藥組出現(xiàn)MSH2基因突變頻率(89.5%)與S-DD組(86.7%)、敏感組(43.5%)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.162，P=0.002)。兩兩比較，以α′=0.016 7 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，結(jié)果提示：耐藥組MSH2基因突變頻率顯著高于敏感組(χ2=9.587，P=0.003)；耐藥組與S-DD組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.064，P=1.000)；中介組與敏感組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.088，P=0.016)。

表3 3組實(shí)驗(yàn)菌株出現(xiàn)MSH2基因突變情況

3 討論

近年來，光滑念珠菌已成為全球第二大引起侵襲性真菌感染的病原體[7]，目前可用于一線治療的抗真菌劑有限，且考慮藥物對(duì)人體副作用(如兩性霉素B的腎毒性)及藥品價(jià)格方面，臨床較常使用唑類藥物。研究[8-9]表明，光滑念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥率逐年升高，Xiao et al[8]通過對(duì)中國醫(yī)院侵襲性真菌檢測(cè)網(wǎng)研究顯示2009～2014年間光滑念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥率從12.9%上升至24.0%，國外也有類似報(bào)道[9]。本研究顯示，2017年7月～2018年7月從我院收集的光滑念珠菌對(duì)氟康唑耐藥率達(dá)22.9%，對(duì)伊曲康唑等其它4種抗真菌藥有不同程度耐藥，同時(shí)存在交叉耐藥和多藥耐藥現(xiàn)象，這與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致。 相關(guān)研究表明，光滑念珠菌易對(duì)唑類產(chǎn)生耐藥[10]，通常與ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和易化擴(kuò)散載體超家族蛋白(如CDR1、SNQ2等)表達(dá)上調(diào)有關(guān)[9]，從而有效的將藥物泵出細(xì)胞外，同時(shí)藥物外排泵上調(diào)通常伴隨轉(zhuǎn)錄因子PDR1獲得性突變[11]，但目前尚不清楚光滑念珠菌為何能快速獲得對(duì)多種藥物的耐藥性。

MMR系缺陷的菌株可增強(qiáng)基因水平轉(zhuǎn)移的頻率[4]，相關(guān)研究[12]顯示，缺乏DNA MMR系統(tǒng)的細(xì)胞，可大大提高自發(fā)突變的速率。Legrand et al[5]通過構(gòu)建白色念珠菌MSH2Δ菌株，研究發(fā)現(xiàn)MSH2基因突變可致氟康唑耐藥菌落的出現(xiàn)頻率增加。同時(shí)，Healey et al[1]通過研究357株光滑念珠菌MSH2基因突變情況及建立MSH2Δ光滑念珠菌胃腸定植小鼠模型，發(fā)現(xiàn)DNA修復(fù)系統(tǒng)缺陷可能是導(dǎo)致負(fù)責(zé)調(diào)控耐藥性的各種基因變化加速的原因。本實(shí)驗(yàn)通過研究57株光滑念珠菌MSH2突變情況，結(jié)果顯示氟康唑耐藥組、S-DD組MSH2基因突變頻率明顯高于敏感組，因此MSH2基因突變可能與氟康唑耐藥有關(guān)。本次研究顯示的P208S/N890I、V239L氨基酸置換位點(diǎn)與國外報(bào)道[1,6]一致，但未發(fā)現(xiàn)E231G、L269F等國外報(bào)道的其他氨基酸置換位點(diǎn)，這可能與實(shí)驗(yàn)菌株數(shù)相對(duì)較少或地理差異有關(guān)。此外，本實(shí)驗(yàn)顯示P208S/N890I氨基酸置換位點(diǎn)只出現(xiàn)在耐藥組中，可能其與出現(xiàn)氟康唑耐藥相關(guān)性較高，這有待進(jìn)一步生物學(xué)驗(yàn)證。同時(shí)，本研究顯示敏感組也出現(xiàn)相對(duì)較高的MSH2基因突變頻率，且有文獻(xiàn)[13]報(bào)道MSH2基因突變出現(xiàn)在耐藥性出現(xiàn)之前，這可能初步解釋了光滑念珠菌為何能快速獲得對(duì)氟康唑的耐藥性，但仍需進(jìn)一步深入研究；也可能與患者基礎(chǔ)疾病較多、接觸較多藥物(如抗生素、抗腫瘤藥物等)有關(guān)。此外，已有研究[1]通過對(duì)連續(xù)臨床光滑念珠菌分離株的分析，結(jié)果表明MSH2基因突變發(fā)生在耐藥性出現(xiàn)之前。

雖然有研究表明DNA MMR基因MSH2基因突變與氟康唑耐藥有關(guān)，但Dellière et al[6]研究提出光滑念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥性與抗真菌藥物暴露相關(guān)，且相關(guān)性優(yōu)于MSH2基因突變。由于病歷資料不完善，本實(shí)驗(yàn)未考慮患者抗真菌藥物的暴露情況。另外，Healey et al[1]發(fā)現(xiàn)從部分醫(yī)院獲得的光滑念珠的MSH2基因突變頻率在氟康唑敏感組與耐藥組有相似水平，表明MSH2基因突變存在地理差異。

本研究為闡明光滑念珠菌MSH2基因突變與氟康唑耐藥有一定關(guān)系，但MSH2突變是否導(dǎo)致DNA MMR蛋白表達(dá)下降，或功能活性降低，或參與調(diào)控其它耐藥基因如藥物外排泵等，有待進(jìn)一步探討。耐藥機(jī)制的形成，復(fù)雜且多樣性[14]，對(duì)其深入研究有助于臨床治療和指導(dǎo)用藥。