高 靜,王 楠，劉阿萍，陳 瑩，關(guān)思靜，胡本祥，顏永剛，張 崗

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 西安 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽(yáng) 712000)

吊竹梅(TradescantiazebrinaBosse)是園林重要觀賞植物，同時(shí)亦可作藥用，有清熱涼血、解毒、利尿的功能[1]，現(xiàn)在大多采用扦插繁殖，但在扦插繁殖中易發(fā)生蒸騰失水，導(dǎo)致植物萎蔫。氣孔是蒸騰失水的重要通道，濕度、溫度、CO2濃度、光照、微生物等許多因素都可影響氣孔運(yùn)動(dòng)，NO、活性氧(ROS)和Ca2+等信號(hào)分子參與氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)[2]。

β-氨基丁酸(BABA)是一種極具潛力的廣譜性植物化學(xué)誘抗劑，不僅可以增強(qiáng)植物的抗病性，還可以提高植物抵抗干旱、高溫、高鹽和重金屬等非生物脅迫的能力[3]。最新的研究顯示BABA可增強(qiáng)酵母誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉現(xiàn)象[4]。筆者研究探索BABA對(duì)吊竹梅氣孔運(yùn)動(dòng)的影響，為后續(xù)BABA作為氣孔抑制劑適度提高水分利用率，促進(jìn)扦插苗的成活率提供一定參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

將吊竹梅種植在培養(yǎng)土(營(yíng)養(yǎng)土、蛭石、珍珠巖1：1：1混合配置)中，溫室培養(yǎng)，適當(dāng)澆水，保持土壤濕潤(rùn)即可[5]。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

BABA、KCl、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、L-抗壞血酸(AsA)、Ca2+螯合劑(EGTA)、Ca2+通道抑制劑(LaCl3)、還原型谷胱甘肽(GSH)、細(xì)胞壁過(guò)氧化物酶抑制劑(SHAM)、NO清除劑(c-PTIO)和NO合成酶抑制劑(L-NAME)均購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 撕取表皮條 取長(zhǎng)勢(shì)良好的吊竹梅植株，并取頂端的第二片完全展開的葉片，用鑷子輕輕撕取下表皮，放入MES-KCl(MES 10 mM，KCl 50 mM，CaCl2100μM pH 6.15)緩沖液中。

1.3.2 氣孔試驗(yàn) 主要有:

(1)誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉：用鑷子輕輕撕取待測(cè)葉片的下表皮條，將其轉(zhuǎn)移至MES-KCl緩沖液中，并在光(400μmol·m-2·s-1)下處理 2 h，使其氣孔完全打開。然后將部分表皮條轉(zhuǎn)入不同濃度(10 μM、100 μM、250 μM)BABA處理液中，并繼續(xù)在光下照射。1 h 后于顯微鏡下觀察，并拍照記錄。

(2)抑制劑處理的表皮條實(shí)驗(yàn)：撕取待測(cè)植株的表皮條，將其轉(zhuǎn)移至將MES-KCl緩沖液中，并在光(400μmoll·m-2·s-1)下處理 2 h。然后將部分表皮條轉(zhuǎn)入含有信號(hào)抑制劑AsA、EGTA、LaCl3、GSH、SHAM、c-PTIO、NaN3和L-NAME的MES-KCl緩沖液中，并在光下繼續(xù)照射0.5 h。再將抑制劑處理過(guò)的表皮條移入BABA溶液中光照1 h 后于顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.4 氣孔開度測(cè)量

每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理至少選取120個(gè)氣孔進(jìn)行測(cè)銷量。用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics, Silver Springs, MD)測(cè)定線段的方法測(cè)量氣孔開度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用 Spss 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)圖均由 Origin 8.0 完成。

2 結(jié)果

2.1 BABA誘導(dǎo)吊竹梅下表皮氣孔關(guān)閉

由圖1看出在經(jīng)過(guò)充分的光照后，吊竹梅的下表皮氣孔完全打開，對(duì)照組的氣孔開度達(dá)到了10.42μm。在用BABA處理1 h后，氣孔開度明顯下降，10 μM、100 μM、250 μM分別使氣孔開度與對(duì)照相比分別下降了26.3%、35.3%和30.5%。100 μM BABA處理過(guò)的吊竹梅氣孔開度最小，隨著BABA濃度增加到250 μM，減小的趨勢(shì)減弱。

圖1 不同濃度BABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉

圖2 活性氧參與BABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉

2.2 ROS在BABA對(duì)吊竹梅葉片氣孔開度影響中的作用

如圖2所示，AsA、GSH和SHAM都逆轉(zhuǎn)了BABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，經(jīng)過(guò)AsA、GSH和SHAM處理后，BABA處理的表皮條氣孔開度分別恢復(fù)到對(duì)照組的97.8%、94.0%和103.7%。

2.3 NO和Ca2+在BABA對(duì)吊竹梅葉片氣孔開度影響中的作用

由圖3和4所示，經(jīng)過(guò)NO 清除劑(c-PTIO)、NR抑制劑(NaN3)和NOS抑制劑(L-NAME)預(yù)處理后，BABA導(dǎo)致的氣孔關(guān)閉分別恢復(fù)到對(duì)照的99.5%、107.4%和106.3%。此外，經(jīng)過(guò)鈣離子螯合劑(EGTA)和鈣離子拮抗劑(LaCl3)處理后，BABA處理的表皮條氣孔開度分別恢復(fù)到對(duì)照組的100.3%和105.7%。

圖3 NO參與BABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉

圖4 Ca2+參與BABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉

3 討論

氣孔是植物體上控制CO2的吸收和水分的散失的重要通道，其開閉運(yùn)動(dòng)受到諸多因素影響。許多信號(hào)物質(zhì)在氣孔開閉信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用，包括產(chǎn)生H2O2的積累、肌動(dòng)蛋白的重組、[Ca2+〗cyt的增加、pH值的改變等[2-4]。本論文的研究表明BABA可以誘導(dǎo)吊竹梅表皮氣孔關(guān)閉。

筆者實(shí)驗(yàn)中的過(guò)AsA、SHAM和GSH完全抑制了BABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，這說(shuō)明ROS參與了BABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，其中SHAM是細(xì)胞壁中的過(guò)氧化物酶抑制劑[6]。先前的研究表明，ROS (H2O2、O2-等)在氣孔運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。在筆者實(shí)驗(yàn)中，BABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉被SHAM有效逆轉(zhuǎn)，這說(shuō)明細(xì)胞壁過(guò)氧化物酶可能參與了BABA誘發(fā)的吊竹梅保衛(wèi)細(xì)胞ROS爆發(fā)過(guò)程。對(duì)SHAM敏感的過(guò)氧化物酶也是SA、UV-A和幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉中H2O2的重要來(lái)源[3-7]。在保衛(wèi)細(xì)胞中，ROS的生成與許多機(jī)制有關(guān)。因此，可以推測(cè)BABA誘導(dǎo)H2O2可能主要由細(xì)胞壁中的過(guò)氧化物酶產(chǎn)生。

現(xiàn)已證明，NO可以和ROS相互作用，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)膜Cl-通道、K+通道、Ca2+和MAPK的活性等控制氣孔運(yùn)動(dòng)[7]，本研究中，NOS抑制劑(L-NAME)、NO清除劑(c-PTIO)、NR抑制劑(NaN3)、鈣離子螯合劑(EGTA)、鈣離子拮抗劑(LaCl3)均扭轉(zhuǎn)了BABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，推測(cè)NO和Ca2+介導(dǎo)了BABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。

4 結(jié)論

BABA可以誘導(dǎo)吊竹梅表皮氣孔關(guān)閉，并且ROS、NO和Ca2+參與其信號(hào)傳遞過(guò)程，細(xì)胞壁中的過(guò)氧化物酶可能是H2O2產(chǎn)生的重要來(lái)源。