古麗米熱·依米提，王延蛟，斯坎德爾·白克力

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊830011)

肝癌是世界上第5大常見惡性腫瘤，在我國排在惡性腫瘤第2位[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Piwi-interacting RNA與Piwi蛋白相作用的RNA(piRNAs)在肝癌中異常表達(dá)，并在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。Piwi/piRNAs通路基因蛋白質(zhì)漩渦同系物基因(Mael)和生殖細(xì)胞特異性蛋白4(Ddx4)為候選癌基因，在多種惡性腫瘤細(xì)胞系中都有表達(dá)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Mael基因在乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌組織中都存在高表達(dá)[4]。Ddx4是一種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，也是細(xì)胞質(zhì)蛋白、干細(xì)胞蛋白、生殖細(xì)胞特異性標(biāo)志物，Ddx4的高表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Piwi/piRNAs可能與肝癌的增殖、抗凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。2017～2018年，我們檢測了大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞中Mael和Ddx4基因mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的變化，探討Mael和Ddx4基因的表達(dá)水平在肝癌中的意義。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞、正常肝細(xì)胞BRL由中科院上海細(xì)胞庫提供。RPMI1640液體培養(yǎng)基和胎牛血清、DEN(純度99.9%)購自美國Sigma公司；Mael、Ddx4和GAPDH引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Mael、Ddx4和GAPDH兔抗鼠單克隆抗體購自Abcam公司；加強(qiáng)型組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒購自聚合美生物公司；RNeasy Mini試劑盒、RT-PCR試劑盒均為Qiagen公司；蛋白裂解液購自美國Thermo公司；引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司根據(jù)設(shè)計合成。

1.2 細(xì)胞分組及培養(yǎng) 將大鼠肝癌細(xì)胞CBRH-7919作為肝癌細(xì)胞組，正常肝細(xì)胞BRL作為正常肝細(xì)胞組，均在無菌條件下加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，細(xì)胞在37 ℃、5%CO2的孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。每次換液之前加入PBS，兩次沖洗細(xì)胞，再用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液換液，均取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.3 Mael、Ddx4 mRNA表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。兩組細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期后，用TRIzol法提取細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取。取質(zhì)量符合要求的RNA產(chǎn)物，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。按SYBR Green Real-time PCR(TaKaRa) 試劑盒的操作步驟進(jìn)行實時熒光定量qRT-PCR。Mael引物上游5′-GAGGATTTCGGTTCCATTGCC-3′，下游5′-TTTCTGATGCCCGCTCCATAC-3′，擴(kuò)增片段189 bp；Ddx4引物上游5′-ACAGGATGTTCCTGCGTGG-3′，下游5′-TGTTCAGTGTGTTCTTGCCCT-3′，擴(kuò)增片段192 bp；GAPDH引物上游5′-CAGGGCTGCCTTCTCTTGTG-3′，下游5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3，擴(kuò)增片段171 bp。反應(yīng)體系：25 μL反應(yīng)體系含1 μL cDNA模板、12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM、1.6 μL上游引物、1.6 μL下游引物、10.3 μL dd H2O。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃起始變性3 min，隨后95 ℃變性10 s，退火30 s(GAPDH退火溫度60 ℃，Mael退火溫度60 ℃，Ddx4退火溫度58 ℃)共40個循環(huán)，延伸65～95 ℃ 10 s，40個循環(huán)。結(jié)果用2-ΔΔCt計算。

1.4 Mael、Ddx4蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。將兩組細(xì)胞加入1 mL裂解液，裂解20 min，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液；吸取加入200 μL BCA液，37 ℃水浴30 min，酶標(biāo)儀測定562 nm處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度；取10 μg用以檢測Mael、Ddx4以及內(nèi)參GAPDH等蛋白質(zhì)，一抗為兔抗鼠多克隆抗體(GAPDH按1∶1 000；Mael按1∶2 000；Ddx4按1∶500)，SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜五次，HRP標(biāo)記的(山羊抗兔1∶10 000)二抗孵育2 h，TBST洗膜五次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行曝光。

2 結(jié)果

2.1 兩組Mael、Ddx4 mRNA表達(dá)比較 肝癌細(xì)胞組Mael、Ddx4 mRNA表達(dá)均高于正常肝細(xì)胞組(P均<0.01)。見表1。

2.2 兩組Mael、Ddx4蛋白表達(dá)比較 肝癌細(xì)胞組Mael、Ddx4蛋白表達(dá)均高于正常肝細(xì)胞組(P均<0.01)。見表1、圖1。

表1 兩組Mael、Ddx4 mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與正常肝細(xì)胞組相比，*P<0.01。

注：1為肝癌細(xì)胞組，2為正常肝細(xì)胞組。

3 討論

肝癌是最常見的腫瘤之一，肝癌的病死率與發(fā)病率在惡性腫瘤中均較高[7]。肝癌發(fā)生發(fā)展是多因素協(xié)同的復(fù)雜過程[8]。目前，對癌癥發(fā)生發(fā)展的研究主要集中在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控方面[9]。piRNAs在肝癌中異常表達(dá)，并在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。piRNAs的失調(diào)能夠通過影響細(xì)胞的生長、凋亡遷移和侵襲等生物學(xué)過程，影響肝癌的發(fā)生和進(jìn)展[10]。piRNAs在癌細(xì)胞中表達(dá)異常，與腫瘤的發(fā)生及擴(kuò)散、疾病的預(yù)后等密切相關(guān)[11]。

Piwi/piRNA通路基因Mael和Ddx4為候選癌基因，在多種惡性腫瘤細(xì)胞系中都有表達(dá)[12]。Mael基因是癌基因，也是睪丸生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因，在肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中都有不同程度的表達(dá)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Mael在多種腫瘤細(xì)胞系中都有表達(dá)，在乳腺癌和肺癌中相對其他腫瘤細(xì)胞系高表達(dá)[14]。Ddx4是一種較為熟知的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，研究發(fā)現(xiàn)Ddx4的高表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞組Mael、Ddx4 mRNA及蛋白表達(dá)均高于正常肝細(xì)胞組，表明大鼠肝癌細(xì)胞中Mael、Ddx4基因和蛋白表達(dá)均明顯增高，可能在肝癌發(fā)生及發(fā)展具有重要作用，可作為肝癌的一項新的分子標(biāo)志物。

綜上所述，大鼠肝癌細(xì)胞中Mael、Ddx4基因和蛋白表達(dá)均明顯增高，Mael和Ddx4基因表達(dá)與肝癌發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系。肝癌細(xì)胞中Mael和Ddx4基因表達(dá)水平變化有可能作為肝癌的檢測及治療的一種分子標(biāo)志物。