劉冬生，高蓉，陳芳昭

(1.杭州中美華東制藥有限公司，浙江 杭州 310011；2.南方醫(yī)科大學，廣東 廣州 510515)

楊梅素(3,5,7-三羥基-2-(3,4,5-三羥基苯基)-4H-1-苯并呋喃-4-酮，Myricetin，MY)與二氫楊梅素[(2R,3R)-3,5,7-三羥基-2-(3,4,5-三羥基苯基)苯并二氫吡喃-4-酮,Dihydromyricetin，DMY]均屬于黃酮類天然小分子化合物，結構式見圖1。現(xiàn)代藥理學研究表明兩者均具有較高的藥用價值具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、護肝等，具有潛在的藥用價值[1-2]。并且，我們前期研究發(fā)現(xiàn)楊梅素和二氫楊梅素具有較好的抗流感病毒活性，在發(fā)揮抗病毒活性的同時，通過抗炎免疫作用減少機體的炎癥反應。其作用機制明確，毒性較低，具有較大的開發(fā)和應用潛力。

圖1 楊梅素、二氫楊梅素結構式

楊梅素、二氫楊梅素可從多種植物中進行提取，來源廣泛，且兩者的提取和分離工藝日臻成熟。其中，楊梅素主要來源于楊梅果實中提取的黃酮類化合物，而二氫楊梅素在藤茶中的含量相對于其他科屬的植物較高，可達到30%以上。因此，楊梅素與二氫楊梅素在藥物的研究與應用中具有資源優(yōu)勢。歐洲一些國家已將楊梅素作為保健食品進行上市，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)也批準楊梅素應用于醫(yī)藥、保健食品和化妝品。歐美國家將楊梅素用作適合特殊人群消炎的添加劑，但國內還未有相關產(chǎn)品上市[3]。其廣泛的藥理活性、豐富的來源及對人體的安全性讓它們擁有發(fā)展成為藥品或保健食品的潛力。

楊梅素、二氫楊梅素的難溶性和易氧化性給它們的應用帶來了很大的局限性，成了在未來的相關制劑開發(fā)中，亟須解決的瓶頸問題。目前，國內外研究者將許多新型制劑技術應用于楊梅素或二氫楊梅素，制備出來一系列新劑型，例如分散片[4]、脂質體[5]、納米凝膠[6]、包合物[7]、微乳[8]等，以提高二者的生物利用度，有效發(fā)揮其藥理作用。新劑型的應用為楊梅素、二氫楊梅素的臨床應用提供了理論基礎，是未來制劑發(fā)展的新動向，但是，這些還僅僅停留在實驗室階段，沒有進行到工業(yè)化生產(chǎn)階段。并且，我國新型制劑的使用率不足5%，遠低于全球的平均水平，這使新劑型的應用在短期時間內，還無法得到廣泛應用[9]。因此，經(jīng)典劑型的應用仍然是我國新藥發(fā)展的重要課題。經(jīng)典劑型如片劑、膠囊劑是我國當今的主要應用劑型，對于楊梅素、二氫楊梅素來說，開發(fā)出能有效應用的經(jīng)典劑型，是其從實驗室邁向工業(yè)化生產(chǎn)的第一步。

片劑是指藥物與輔料均勻混合后壓制而成的片狀制劑，是現(xiàn)代藥物制劑中應用最為廣泛的重要劑型之一，具有口服吸收方便、劑量準確、含量均勻、便于儲存運輸、受外界空氣、光線、水分等因素的影響較少并可通過包衣保護等優(yōu)點，容易應用于工業(yè)化大生產(chǎn)，并可因臨床應用的需要制成分散片、緩釋片、控釋片等不同功能劑型。在此研究中，片劑作為首選研究劑型，有利于主藥分別為楊梅素、二氫楊梅素的劑型應用及擴大化生產(chǎn)。

根據(jù)制備工藝的不同，片劑可分為直接壓片法和制粒壓片法，而制粒壓片法又分為濕法制粒壓片和干法制粒壓片，其中濕法制粒是我國藥企應用最為廣泛的方法。直接壓片法省去了制粒、干燥等步驟，簡化工序，適用于對濕熱不穩(wěn)定的藥物。與直接壓片法相比，制粒壓片法可改善物料的流動性、可壓性，減少物料各成分的分層，使片劑含量均勻，并可避免細粉飛揚造成損失和交叉污染等問題。對于流動性較差的物料，還是需要制粒壓片法來制備片劑。由于楊梅素、二氫楊梅素原料藥本身流動性較差，不利于直接壓片，并且楊梅素可在100 ℃以下[10]、二氫楊梅素可在220 ℃以下保持穩(wěn)定[11]，遠高于濕法制粒中干燥步驟的溫度(60 ℃)，適用濕法制粒。故在本研究中，選用濕法制粒壓片法改善其流動性，便于壓片成型及控制含量。

在本研究中，我們旨在探索楊梅素片與二氫楊梅素片的處方工藝，并制備符合崩解時限要求的相關片劑，為兩者的生產(chǎn)應用及后期生物利用度考察奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 80目篩網(wǎng)(上海寶藍實驗儀器制造有限公司)；20目篩網(wǎng)(上海寶藍實驗儀器制造有限公司)；PL203電子天平(梅特勒-托多利儀器(上海)有限公司)；YD-4片劑硬度測定儀(創(chuàng)天有限公司)；FT-2000A脆碎度測定儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)；DHG-9053A電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；MB35水分測定儀(美國奧豪斯公司Ohaus)；ZPS8-旋轉式壓片機(中外合資上海天祥·健臺制藥機械有限公司)；ZB-1E智能崩解儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)；G6實驗型多功能濕法混合制粒機(深圳市信宜特科技)；JZ-7型粉體振實密度儀(成都精新粉體測試設備有限公司)；粉末流動性測定儀(成都精新粉體測試設備有限公司)；P100粉碎整粒機(深圳市信宜特科技)；DPL-0.2多功能制粒包衣機(重慶精工制藥機械有限責任公司)；UV-2450型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)。

1.1.2 試藥 楊梅素(武漢遠城科技有限公司，批號：2018.07.25)；二氫楊梅素(武漢遠城科技有限公司，批號2018.07.16)；微晶纖維素(德國JRS藥用輔料公司)；乳糖(德國美劑樂集團)；羥丙纖維素(HPC，Aqualon Company)；低取代羥丙纖維素(L-HPC，日本曹達株式會社)；羧甲基淀粉鈉(CMS-Na，湖州展望藥業(yè)有限公司)；交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(CCMC-Na，F(xiàn)MC BioPolymer)；硬脂酸鎂(湖州展望藥業(yè)有限公司)；薄膜包衣預混劑(胃溶型，上海可樂康包衣技術有限公司);甲醇(色譜純，Anaqua Chemicals Supply);水為純化水。

1.2 方法

1.2.1 片劑制備工藝 采用濕法制粒法分別制備楊梅素片、二氫楊梅素片。工藝流程圖見圖2。在前期探索時用人工擠壓法進行制粒，在處方確定之后采用濕法混合制粒機進行制粒，工藝分別如下：

人工法：主藥與輔料分別過80目篩后混勻，加入適量純化水制軟材，過20目篩制粒，于電熱鼓風干燥箱干燥至水分低于3%后過20目篩整粒，加入外加部分的崩解劑與潤滑劑硬脂酸鎂充分混勻，壓片，并在壓片過程中控制片重與片劑硬度(約10 kg)。

機器法：將用于制粒的原輔料倒入多功能濕法混合制粒機，先混合均勻，再加入適量純化水，采用制粒模式進行切割制粒。制粒完成后用流化床對顆粒物進行干燥，至水分低于3%后，用整粒機進行整粒，再加入外加部分崩解劑與潤滑劑硬脂酸鎂，充分混勻后進行壓片，并在壓片過程中控制片重與片劑硬度(約10 kg)。

圖2 工藝流程圖

1.2.2 堆密度檢測 在楊梅素、二氫楊梅素顆粒制備完成后，與外加部分崩解劑與潤滑劑硬脂酸鎂充分混勻，形成壓片前粉末，對其進行振實密度檢測。使用JZ-7型粉體振實密度儀，將適量藥品粉末稱重后，記錄質量m，輕輕倒入密度儀量筒，記錄其振前體積V1。啟動密度儀振動1 000次后，記錄振后體積V2，計算粉體振實最緊堆密度f、最松堆密度0與壓縮度C=(f-0)/f×100%，并判斷其流動性。

1.2.3 粉體流動性檢測 休止角是粒子在粉體堆體積層的自由斜面上滑動時所受重力和粒子間摩擦力達到平衡而處于靜止狀態(tài)下測得，是檢驗粉體流動性的好壞的最簡便的方法。休止角越小，摩擦力越小，流動性越好，一般認為θ≤40°時可以滿足生產(chǎn)流動性的需要。將粉末注入流動性測定儀漏斗中，直至粉末完全流出，并且粉末頂端與漏斗底部接觸，記錄粉末椎體高度h及半徑r，tanθ=h/r。

1.2.4 崩解時限檢查 將純凈水注入智能崩解儀并預熱至37 ℃，取6片片劑分別置于吊籃中，啟動崩解儀，設定崩解時間為15 min，待崩解儀達到工作時間后，取出崩解框，觀察片劑崩解情況。普通片劑的崩解標準為：15 min內全部崩解或成碎粒，并全部通過篩網(wǎng)。

1.2.5 片劑脆碎度檢測 將所得片劑用吹風機吹去表面浮粉后，精密稱取約6.5 g片劑，置脆碎度測定儀圓筒中，轉動100次，轉速(25±1)次/min。取出，同法除去粉末，精密稱重，減失重量不得過1%，且不得檢出斷裂、龜裂及粉碎的片。

1.2.6 紫外-可見分光光度法測定含量(對照品比較法)

1.2.6.1 對照品溶液制備 取楊梅素和二氫楊梅素原料粉末，分別加甲醇制成對照品儲備液。精密量取各儲備液適量，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為6.40 μg·mL-1的楊梅素對照品溶液，和濃度為6.40 μg·mL-1的二氫楊梅素對照品溶液。

1.2.6.2 供試品溶液制備 取20片藥物研細，精密稱取適量(約相當于1片重量)，作為供試品(約含100 mg藥物)，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇并定容至刻度，于37 ℃超聲破碎溶解15 min，置于室溫放涼后，搖勻。取2 mL至25 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，混勻。再取1 mL溶液至25 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，用0.22 μm微孔濾膜濾去不溶性輔料后，即得供試品溶液。

1.2.6.3 測定方法 對照品比較法。分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分規(guī)定量的100%±10% ，所用溶劑也應完全一致，在規(guī)定的波長處測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度：

Cx=(Ax/Ar)×Cr

其中，Cx：供試品溶液的濃度；Ax：供試品溶液的吸光度；Cr：對照品溶液的濃度；Ar：對照品溶液的吸光度。

2 結果

2.1 楊梅素片、二氫楊梅素片的處方探索

2.1.1 原始處方(人工法) 處方(崩解劑內加；片重：250 mg)見表1。成片質量考察見表2。

表1 原始處方

表2 原始處方成片質量考察

結果分析：① 250 mg片重使成片太厚，建議片重調整至200 mg。② 楊梅素片在15 min內全部沒有崩解，而二氫楊梅素片崩解符合《中國藥典》要求，兩者處方相同，崩解時限差異考慮是主藥性質導致。

2.1.2 改進處方(人工法) 在前面所述實驗中，楊梅素片完全不崩解，與二氫楊梅素片崩解合格相比較，應是主藥成分導致片劑不崩解，故考慮以下兩種方式改善楊梅素片崩解度，并調整片重為200 mg：①不用黏合劑，利用主藥本身黏性發(fā)揮黏合作用；②不用黏合劑且降低主藥楊梅素含量。結果如下：① 不用黏合劑組處方：見表3。② 不用黏合劑且降低楊梅素主藥含量組處方：見表4。

表3 改進處方(不用黏合劑)

表4 改進處方(不用黏合劑且降低主藥含量)

結果：因硬脂酸鎂減慢崩解作用，故崩解劑L-HPC采用外加法加入。兩個處方所得片劑，在15 min內均不崩解，故考慮L-HPC不適合作為楊梅素片的崩解劑，應該更換。

2.1.3 更換崩解劑(人工法) 由于L-HPC無法使楊梅素片在規(guī)定時間內崩解完全，故考慮更換崩解劑。在常用的崩解劑中，羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)是一種白色無定型粉末，吸水膨脹作用非常顯著,吸水后可膨脹至原體積的300倍；交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(CCMC-Na)不溶于水，通過毛細管作用與吸水膨脹作用產(chǎn)生崩解效應，與水接觸后體積迅速膨脹至原體積的4～8倍[12]?？紤]采用CMS-Na或CCMC-Na作為崩解劑(崩解劑內外加法(3∶1)分別考察楊梅素片崩解效果。處方(200 mg/片)：見表5。

表5 用CMS-Na或CCMC-Na代替L-HPC作為崩解劑的處方

對制備所得楊梅素片，進行崩解作用探索，結果如下：①崩解劑為CMS-Na：在10 min內，楊梅素片全部崩解；②崩解劑為CCMC-Na：10 min時，6片中剩下1片剩少量黏住擋板，15 min時仍如此，但質地松軟。

綜上，選擇采用CMS-Na作為崩解劑制備楊梅素片，并考察用此處方制備的二氫楊梅素片的崩解效果。

2.1.4 楊梅素片與二氫楊梅素片處方確定與崩解時限檢查(機器法) 由于“2.1.3”項下處方可使楊梅素片崩解時限達到藥典規(guī)定要求，故采用該處方，用機器法制備楊梅素片和二氫楊梅素片，考察崩解劑CMS-Na的不同加入方法對片劑崩解的影響，結果見表6。

表6 崩解劑CMS-Na加入方法對片劑崩解的影響

崩解時限比較：在外加法與內外加法中，片劑的崩解度均較好，符合《中國藥典》規(guī)定要求。

成片外觀比較：外加法光潔程度與內加法、內外加法相比，有些許花片，原因應為外加法時，制粒后加入粉末比例較多，混合不夠均勻，導致表面斑駁或者表面不光潔。

綜上，內外加法既保證片劑崩解度，又能讓成片光潔，故在后續(xù)實驗采用內外加法，崩解劑以3∶1分別在制粒前∶后加入的方法制備楊梅素片與二氫楊梅素片，并對所得片劑進行包衣，以保護片劑免受空氣氧化(包衣液：歐巴代02B38190-CN 黃色；包衣增重：3% )。兩者的普通片及包衣片外觀(見圖3)。

普通片包衣片楊梅素片二氫楊梅素片圖3 楊梅素片、二氫楊梅素片外觀

2.2 粉體堆密度檢測 ①楊梅素顆粒：m=23.90 g，V1=50 mL，V2=42 mL；最緊堆密度ρf=m/V2=23.90/42=0.57，最松堆密度ρ0= m/V1=23.90/50=0.478；壓縮度：C=(ρf-ρ0)/ ρf×100%=16%；②二氫楊梅素顆粒：m=22.65 g， V1=50 mL，V2=38 mL

最緊堆密度ρf= m/V2=22.65/38=0.596，最松堆密度ρ0= m/V1=22.65/50=0.453；壓縮度：C=(ρf-ρ0)/ ρf×100%=23.99%

一般認為，壓縮度在20%以下流動性較好，40%～50%時流動性較差，所以，兩種顆粒流動性均較好。

2.3 粉體流動性檢測 通過測定粉末椎體的高度h與半徑r，計算其休止角：

楊梅素：r=3,h=2，tan=h/r=0.67，=33.82°

二氫楊梅素：r=3,h=2.1，tan=h/r=0.7，=34.99°

<40°時流動性符合生產(chǎn)要求，故楊梅素顆粒與二氫楊梅素顆粒粉末均具有良好的流動性，符合進一步的制劑研究要求。

2.4 壓片并包衣后崩解時限檢查 結果見表7。

表7 楊梅素片、二氫楊梅素片包衣前后崩解時限檢查

在對楊梅素片、二氫楊梅素片進行包衣后，崩解時限仍在15 min內，說明兩者的片劑均具有良好的崩解度，符合進一步研究的要求。

2.5 脆碎度檢測 楊梅素片：檢測前重量6.431 6 g，檢測后重量6.428 2 g，減重0.05%。二氫楊梅素片：檢測前重量6.506 1 g， 檢測后重量6.461 6 g，減重0.67%，均符合減重不超過1%要求。

2.6 對照品比較法測定含量

2.6.1 檢測波長的選擇 用紫外-可見分光光度計對楊梅素、二氫楊梅素對照品溶液進行掃描(200～800 nm)，得紫外-可見吸收光譜圖如下。楊梅素最大吸收波長209.20 nm，二氫楊梅素最大吸收波長為208 nm。兩者最大波長相近，選取209.20 nm作為檢測波長分別對兩者的供試品進行檢測。楊梅素、二氫楊梅素紫外光譜分別見圖4～5。

圖4 楊梅素紫外光譜圖

圖5 二氫楊梅素紫外光譜圖

2.6.2 精密度試驗 取楊梅素供試品溶液和二氫楊梅素供試品溶液各1份，分別于209.2 nm波長處測定吸光度，連續(xù)6次。計算RSD分別為楊梅素0.58%，二氫楊梅素0.67%。表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復性試驗 取楊梅素供試品溶液和二氫楊梅素供試品溶液各6份，分別于209.2 nm波長處測定吸光度，計算RSD分別為楊梅素0.71%，二氫楊梅素0.51%。表明本方法重復性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗 取楊梅素供試品溶液和二氫楊梅素供試品溶液各1份，分別于0、4、8、12、16、24 h，在209.2 nm波長處測定吸光度，計算RSD分別為楊梅素0.93%，二氫楊梅素0.87%。表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.6.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的楊梅素片粉末(含楊梅素50%)和二氫楊梅素片粉末(含二氫楊梅素50%)各6份，各100 mg。分別精密加入楊梅素對照品儲備液(含楊梅素50 mg)和二氫楊梅素對照品儲備液(含二氫楊梅素50 mg)。按本試驗供試品溶液制備及測定方法進行測定。結果平均回收率為楊梅素98.6%，二氫楊梅素101.1%。表明本方法準確度良好。

2.6.6 樣品含量的測定 ①楊梅素(按200 mg/片)：結果見表8。計算每片含量得：C1=93.75 mg，C2=93.17 mg，C3=95.40 mg，平均含量 C=94.09 mg，RSD=1%。

②二氫楊梅素(按200 mg/片)：結果見表9。計算每片含量得：C1=114.35 mg,C2=109.63 mg,C3=104.08 mg，平均含量 C=109.35 mg，RSD=5%。

楊梅素片、二氫楊梅素片含量均在設定含量100 mg的100%±10%以內，相對標準偏差RSD均符合要求。

表8 對照品及供試品中楊梅素的吸光度

表9 對照品及供試品中二氫楊梅素的吸光度

3 討論

在處方中輔料選擇上，選用微晶纖維素與乳糖共同作為填充劑，其中微晶纖維素具有良好的可壓性，壓出的片劑緊密卻具有良好的崩解性，在處方含量大于20%時崩解性較好，而乳糖水溶性好，使壓出的片子表面光滑、美觀，有利于提高藥物的溶出度。二者相結合，可使所得片劑光潔美觀，具有良好的崩解性能和溶出度。黏合劑選擇羥丙纖維素(HPC)。在最初的處方中，選用低取代羥丙纖維素(L-HPC)作為崩解劑，但所得片劑崩解性能較差，楊梅素片無法在規(guī)定時間內崩解，換用吸水膨脹作用顯著的羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)與兼?zhèn)涿毠茏饔门c吸水膨脹作用的交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(CCMC-Na)，均取得較好的崩解效果，最后，選擇崩解性能最好的CMS-Na作為最終處方的崩解劑。在制得藥物顆粒之后，添加1%的硬脂酸鎂作為潤滑劑，可使顆粒的可壓性與流動性更好，所得片劑光潔美觀。

上述對楊梅素片和二氫楊梅素片進行了處方探究，摸索出能夠滿足崩解時限要求，并且崩解度良好的片劑處方。在該處方制備所得的粉體顆粒和片劑中，分別進行了粉體流動性相關檢查和片劑基本質量要求的檢測，結果發(fā)現(xiàn)，該處方所得顆粒的粉體流動性較好，具備壓成片劑的性能。在壓成片劑之后，片劑的脆碎度、硬度均符合要求。且其單劑標示量大于25 mg，不用進行含量均勻度檢查。使用紫外-可見分光光度法測定其含量，發(fā)現(xiàn)兩者含量均在標示量的100%±10%以內，符合要求。

但在此研究中，仍存在不足之處：①含量測定方法較粗略，沒有采用精密度更高的HPLC進行含量測定；②僅進行了崩解時限檢查，沒有對所得片劑進行溶出度檢測，不能準確預測其生物利用度；③含量測定結果雖在允許范圍內，但偏差仍較大，可能原因為實驗過程大多采用人工控制條件和影響因素，導致與預測含量有所差異。在往后的研究中，需要進一步規(guī)范實驗流程，采用機器生產(chǎn)進行更嚴密的條件控制，解決兩者溶解度不佳、容易氧化等缺點帶來的問題，并且進行溶出度檢查，針對溶出度結果等實驗數(shù)據(jù)繼續(xù)優(yōu)化處方工藝，以達到良好的生物利用度及滿足制劑生產(chǎn)的要求。

總的來說，此研究為楊梅素、二氫楊梅素制備成片劑提供了思路，為兩者制備成真正可以應用于臨床研究的制劑進行了前期探索。