龔英菲 曾現(xiàn)歡 趙維俊 左俊濤 朱鐘凱 王湛博 劉 偉 王 昀 楊 勇

(中國藥科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，南京 211198)

生殖毒性試驗(yàn)的目的是通過動(dòng)物試驗(yàn)反映受試物對(duì)哺乳動(dòng)物生殖功能和發(fā)育過程的影響。胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)(即Ⅱ段生殖毒性試驗(yàn)) 是評(píng)價(jià)新藥生殖毒性的首選方法之一。妊娠動(dòng)物自胚胎著床至硬腭閉合給藥，觀察受試物對(duì)妊娠動(dòng)物母體、胚胎和胎仔發(fā)育的影響，包括胚胎胎仔的死亡、生長改變和結(jié)構(gòu)變化等，為母體孕期接觸新藥可能對(duì)胎兒造成的影響提供臨床前的試驗(yàn)依據(jù)[1]。環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide)是一種氮芥類烷化劑，對(duì)多種腫瘤具有明顯的抑制作用，對(duì)增殖細(xì)胞群的各期均有殺傷作用，具有較強(qiáng)的致畸、致癌和致突變作用。研究表明環(huán)磷酰胺可造成精子缺乏、精子畸形、停經(jīng)等生殖系統(tǒng)毒性，妊娠初期給予可致畸胎。但目前生殖毒性研究主要集中于大鼠和小鼠[2-6]，用于兔生殖毒性研究很少。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局2006 年發(fā)布的《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，兔是胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究中優(yōu)先選用的非嚙齒類動(dòng)物，但I(xiàn)I 段生殖毒性試驗(yàn)中關(guān)于兔陽性藥物的致畸背景資料較少[7]。因此，選用陽性對(duì)照物并確定相關(guān)的致畸作用對(duì)新開展此項(xiàng)試驗(yàn)具有實(shí)際指導(dǎo)意義[8]。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

環(huán)磷酰胺(批號(hào)P01637) 購自阿達(dá)瑪斯貝塔(上海)化學(xué)試劑有限公司，白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，臨用前用生理鹽水配制;茜素紅(批號(hào)20110315) 購自天津市化學(xué)試劑研究所，褐色固體粉末；硫化銨(批號(hào)13071020653) 購自南京化學(xué)試劑有限公司，白色固體結(jié)晶；氫氧化鉀(批號(hào)20131230) 購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，白色固體粉末；丙三醇(批號(hào)20140118) 購自江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司，無色澄清溶液；乙醇(批號(hào)20140821) 購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，無色澄清溶液。

1.2 動(dòng)物

新西蘭兔購自青島康大生物科技有限公司，普通級(jí)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK (魯) 2012-0005，飼養(yǎng)于中國藥科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，普通級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SCXK (蘇) 2013-0013，溫度21～25 ℃，相對(duì)濕度44%～68%，光照12 h; 單只飼養(yǎng)于不銹鋼籠內(nèi)。飼料為北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)的兔生長繁殖飼料，飲用水為CENTRA-R200凈化系統(tǒng)凈化處理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水，籠具和托盤每日清潔更換。

1.3 儀器

體式顯微鏡，型號(hào)(SZX7)，Olympus；正置生物顯微鏡，型號(hào)(BX43)，Olympus； 電子天平，型號(hào)(QUINTIX224-1CN，QUINTIX1102-1CN， PRACTUM2102- 1CN)；賽多利斯；游標(biāo)卡尺，型號(hào)(BZ)，成都成量工具集團(tuán)有限公司。

1.4 方法

1.4.1動(dòng)物分組與給藥方案：購買4～5月齡的孕兔40只，交配成功日計(jì)為 GD0，并按照體質(zhì)量均衡原則隨機(jī)分為對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組。最終納入統(tǒng)計(jì)對(duì)照組(0.9%氯化鈉注射液，i.v)16只，環(huán)磷酰胺組(30 mg/kg，i.v.)17只。

1.4.2觀察和檢測：試驗(yàn)期間進(jìn)行一般臨床癥狀觀察，體質(zhì)量和攝食量的測定。GD28對(duì)孕兔進(jìn)行過量CO2安樂死，剖宮稱取懷孕子宮總質(zhì)量、子宮、胎盤、卵巢及腦質(zhì)量。記錄黃體數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)、著床腺數(shù)，并計(jì)算子宮、卵巢臟體、臟腦系數(shù)。取出胎仔，存活胎仔自腹腔注射戊巴比妥鈉溶液實(shí)施安樂死后記錄胎仔性別、胎仔質(zhì)量、頂臀長、尾長及外觀。全部胎仔進(jìn)行內(nèi)臟和骨骼檢查，其中除心臟、腦、腎臟用4%甲醛溶液固定后檢查，其余內(nèi)臟當(dāng)即檢查，骨骼標(biāo)本用95%的乙醇固定和茜素紅染色后檢查。胎仔外觀畸形檢查包括頭部、四肢、軀干、尾部和肛門。胎仔內(nèi)臟畸形檢查包括有無腭裂、腦水腫、腎積水，眼球是否正常，心、肝、脾、肺、腎和子宮等臟器大小和位置是否異常等。胎仔骨骼畸形檢查包括骨化程度、有無胸骨節(jié)缺失、骨化不全、胸骨節(jié)錯(cuò)位、多肋、少肋、肋骨分叉、肋融合、波狀肋等。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來表示，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，如果采用P>0.05再進(jìn)行t檢驗(yàn)，如果P<0.05進(jìn)行秩和檢驗(yàn)；有吸收胎的孕兔百分率、有死胎的孕兔百分率、妊娠率、窩別外觀(內(nèi)臟、骨骼)畸形率和窩別內(nèi)臟(骨骼)變異率等采用百分率表示，采用Fisher確切概率法進(jìn)行分析。P<0.05確認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)一般臨床癥狀觀察、體質(zhì)量和攝食量的影響

一般臨床癥狀觀察未見明顯異常。GD14～16孕兔的體質(zhì)量增長環(huán)磷酰胺組較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，給藥后環(huán)磷酰胺組的攝食量較對(duì)照組出現(xiàn)一過性的降低(GD11P<0.05)。

2.2 對(duì)孕兔生殖功能及胚胎形成的影響

與對(duì)照組相比，孕兔終末體質(zhì)量(GD28)、懷孕子宮質(zhì)量、胎盤質(zhì)量、子宮質(zhì)量、卵巢質(zhì)量及其臟體和臟腦系數(shù)均未見明顯差異。

環(huán)磷酰胺組較對(duì)照組著床后丟失率提高近一倍。黃體數(shù)、死胎數(shù)、著床腺數(shù)、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)、總丟失率無明顯異常。詳見下表1：

表1 環(huán)磷酰胺對(duì)孕兔生殖功能及胚胎形成的影響Table 1 The effect of Cyclophosphamide on rabitreproduxtion and embryo-fetal development

2.3 對(duì)胎仔外觀的影響

與對(duì)照組相比，胎仔總質(zhì)量，均質(zhì)量分別降低9.62%和16.47%；胎仔身長、尾長分別減少8.00%和17.55%(P<0.05)；腭裂畸形率(32.95%)明顯高于對(duì)照組，與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且窩別的腭裂畸形率為73.33%，與對(duì)照組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。詳見下表2：

表2 環(huán)磷酰胺對(duì)胎仔外觀的影響Table 2 The effect of Cyclophosphamide onappearance of fetal rabits

注：*表示與對(duì)照組比P<0.05

Note：*Compared with the control groupP<0.05

2.4 對(duì)胎仔內(nèi)臟的影響

環(huán)磷酰胺組：胎仔的窩別內(nèi)臟變異率為80.00%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，主要變異類型為左心室偏大；胎仔的窩別內(nèi)臟畸形率為73.33%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，主要畸變類型為腎皮質(zhì)髓質(zhì)分界不清。詳見下表3：

表3 環(huán)磷酰胺對(duì)胎仔內(nèi)臟檢查指標(biāo)的影響Table 3 The effect of Cyclophosphamide on fetal organs

注：*表示與對(duì)照組比P<0.05

Note：*Compared with the control groupP<0.05

2.5 對(duì)胎仔骨骼的影響

環(huán)磷酰胺組：除胸椎、肋骨骨化數(shù)與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)外，枕骨骨化程度、其他骨化數(shù)及胎仔窩別骨骼變異率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。胎仔骨骼畸變率為86.67%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見下表4：

表4 環(huán)磷酰胺對(duì)胎仔骨骼檢查指標(biāo)的影響Table 4 The effect of Cyclophosphamide on fetal skeleton

注：*表示與對(duì)照組比P<0.05

Note：*Compared with the control groupP<0.05

3 討論

本研究中，以環(huán)磷酰胺作為陽性藥物，采用靜脈注射途徑、給藥劑量30 mg/kg、給藥時(shí)間GD11，觀察環(huán)磷酰胺對(duì)新西蘭兔胎仔畸形的影響以確定此方法可行程度。

環(huán)磷酰胺作為廣譜的抗癌藥物，藥物的不良反應(yīng)也較突出，特別是在生殖方面。環(huán)磷酰胺能透過血胎屏障和血乳屏障，所以臨床上妊娠婦女禁用，哺乳期婦女用藥時(shí)必須停止哺乳。

不同給藥途徑的相對(duì)吸收率不同，一般依次為靜脈注射>經(jīng)口給藥>皮下注射[9]。有報(bào)道給兔GD6～20連續(xù)灌胃給予環(huán)磷酰胺18 mg/kg畸形比例適當(dāng)，胎仔生長發(fā)育也受到明顯的影響[10]。皮下注射環(huán)磷酰胺畸形比例較高，胎仔的體格和生長發(fā)育會(huì)受到明顯影響，吸收胎數(shù)量較多，導(dǎo)致可供進(jìn)行檢查的胎仔數(shù)量略少[8]，但本研究前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，新西蘭兔GD6～20進(jìn)行連續(xù)經(jīng)口灌胃給予環(huán)磷酰胺18 mg/kg·d-1會(huì)導(dǎo)致孕兔出現(xiàn)流產(chǎn)，亦會(huì)導(dǎo)致檢查的胎仔數(shù)量減少。所以正式試驗(yàn)的過程中選擇靜脈注射，耳緣靜脈注射給藥操作較為簡單且對(duì)動(dòng)物造成的應(yīng)激性較小，靜脈注射吸收率高從而使用環(huán)磷酰胺較少。

本研究中發(fā)現(xiàn)給藥后環(huán)磷酰胺組較對(duì)照組體質(zhì)量和攝食量有一定的降低，說明本試驗(yàn)采用的30 mg/kg環(huán)磷酰胺在試驗(yàn)過程中對(duì)孕兔產(chǎn)生了一定的毒副作用，為一過性的。如果劑量加大或者是給藥頻次增加，可能會(huì)導(dǎo)致毒性太大，對(duì)胎仔產(chǎn)生不可逆的影響，致使胎仔出現(xiàn)死亡或者流產(chǎn)，會(huì)導(dǎo)致樣本缺失，無法分析。從胎仔的外觀上來看，環(huán)磷酰胺組和對(duì)照組窩胎仔總數(shù)沒有明顯差異，但環(huán)磷酰胺組胎仔的均質(zhì)量、身長、尾長均低于對(duì)照組，四肢的畸變率明顯高于對(duì)照組。對(duì)胎仔內(nèi)臟進(jìn)行檢查，環(huán)磷酰胺組的變異率和畸形率明顯高于對(duì)照組。對(duì)胎仔的骨骼進(jìn)行檢查，環(huán)磷酰胺組骨骼的畸變種類和數(shù)目都明顯高于對(duì)照組。有報(bào)道雌性大鼠GD7～11 靜脈注射環(huán)磷酰胺5 mg/kg·d-1，GD20剖取胎仔，發(fā)現(xiàn)對(duì)中軸骨骼畸形的誘導(dǎo)具有階段和部位特異性。本研究采取的GD11亦處于中軸骨骼發(fā)生畸形的敏感期[11]。本研究中環(huán)磷酰胺GD11 給藥組骨骼畸形的比例為86.67%，基本全部集中于中軸骨骼。環(huán)磷酰胺作用機(jī)理體內(nèi)被肝臟或腫瘤內(nèi)存在的過量磷酰胺酶或磷酸酶水解變成活化的磷酰胺氮芥與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA的合成，特別是G2期(DNA合成后期)，干擾RNA的功能，從而導(dǎo)致胎仔發(fā)育遲緩，外觀、內(nèi)臟、骨骼的畸變。環(huán)磷酰胺還會(huì)使T細(xì)胞和B細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目減少，從而影響免疫系統(tǒng)的發(fā)育[12]。綜上所述可知我們采用30 mg/kg環(huán)磷酰胺在GD11給予孕兔，對(duì)胎仔產(chǎn)生的畸變種類較為合適。選用環(huán)磷酰胺作為生殖毒性試驗(yàn)的陽性對(duì)照是合適的。

在本實(shí)驗(yàn)條件下。30 mg/kg環(huán)磷酰胺對(duì)孕兔生殖功能及胚胎形成無明顯影響，但可顯著影響胎仔發(fā)育，可引起胎仔外觀畸形、內(nèi)臟變異、內(nèi)臟畸變和骨骼畸變。本次實(shí)驗(yàn)方法可靠。