于子婷

(北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，北京 100012)

腸道是人體消化吸收的重要場(chǎng)所，也是人體最大的免疫器官，在機(jī)體正常運(yùn)作中發(fā)揮著極其重要的作用。據(jù)報(bào)道成年人的腸道中含有約 1000 多種不同類型的細(xì)菌，腸道菌群紊亂是2 型糖尿病、動(dòng)脈硬化、肥胖癥、骨質(zhì)疏松、胃腸道疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要誘因[1-2]，因此保持腸道微生態(tài)的平衡對(duì)人體健康具有重要意義。

茶是世界第二大消費(fèi)飲料，茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)及其衍生物的總稱,主要由兒茶素、黃酮類、花青素、花白素和酚酸等物質(zhì)組成[3]，茶多酚在原發(fā)高血壓、高血脂的防治中作用顯著。另外，茶多酚在消炎止瀉上作用也比較明顯。研究表明茶多酚可抑制很多真菌、細(xì)菌的活動(dòng)。其殺菌及抑菌的種類有：口中的黏放菌、變鏈菌；消化器官中的金黃色鏈球菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、螺旋菌等多類細(xì)菌；皮膚上的白癬菌、新型隱形球酵母、發(fā)癬菌；為人體帶來(lái)多種危害的棱菌屬菌[4]。

隨著腸道微生物的研究深入，研究發(fā)現(xiàn)茶葉中的不能被人體消化吸收的多酚和多糖對(duì)腸道微生物的調(diào)節(jié)可能是茶葉發(fā)揮其活性主要作用的靶點(diǎn)之一[5]，本研究主要研究茶葉中的茶多酚在影響宿主的腸道微生物多樣性及結(jié)構(gòu)中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

將 24 只 C57BL/6 J 小鼠在恒溫、恒濕的 SPF 級(jí)動(dòng)物房中適應(yīng)性飼喂1周，嚴(yán)格控制 12 h 光照/黑暗，環(huán)境溫度設(shè)定為 23℃，期間小鼠自由進(jìn)食和進(jìn)水。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所用的方法都經(jīng)過(guò)北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心動(dòng)物倫理協(xié)會(huì)批準(zhǔn)。1周適應(yīng)期結(jié)束后，24只8周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為4組，每組6只：對(duì)照組(CK，不添加茶多酚)、低劑量茶多酚組(LTP，飲水中添加0.4 g/L GTP)、中劑量茶多酚組(MTP，飲水中添加0.8 g/L GTP)、高劑量茶多酚組(TP，飲水中添加1.6 g/L GTP)。4組均給予常規(guī)飼料，茶多酚飲水每天更換一次，連續(xù)14 d。

1.3 樣品采集及處理

處理14 d后，收集小鼠直腸中的新鮮糞便，約150 mg，放入無(wú)菌的 EP 管中，密封，1 h內(nèi)置于-80℃冰箱進(jìn)行保存，所有的操作需在 1 h 內(nèi)完成。

1.4 DNA 提取

DNA提取方法參照DNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross,GA,U.S.)試劑盒說(shuō)明書(shū)。提取得到的DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和分光光度法(A260 nm/A280 nm光密度比)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。檢測(cè)后，將樣品于20 ℃保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.5 MiSeq 測(cè)序

微生物多樣性檢測(cè)選取細(xì)菌16SrDNA V3-V4區(qū)，樣本送至北京奧維森基因科技有限公司，利用 Illumina Miseq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。細(xì) 菌 16S rDNA V3-V4 擴(kuò) 增 引 物 為 338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和 806R(5’-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3’)。PCR反應(yīng)體系：12.5 μL 2× Taq PCR MasterMix, 3 μL BSA(2ng/μL), 2 μL Primer(5 μmol/L), 2 μL 模板 DNA, 和5.5 μL ddH2O。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃ 延伸45 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.6 生物信息學(xué)分析

通過(guò)Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行Paired-end 測(cè)序，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)QIIME(v1.8.0)軟件過(guò)濾、拼接、去除嵌合體，去除打分低于20、 堿基模糊、引物錯(cuò)配或測(cè)序長(zhǎng)度小于150 bp的序列。 根據(jù)barcodes歸類各處理組序列信息聚類為用于物種分類的OTU(Operational Taxonomic Units)，OTU 相似性設(shè)置為97%。對(duì)比silva數(shù)據(jù)庫(kù)，得到每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)的物種分類信息。 再利用Mothur 軟件(version 1.31.2)進(jìn)行Shannon指數(shù)分析?；赪eighted Unifrace 距離，使用R(v3.1.1)軟件包的heatmap 進(jìn)行聚類分析。

基于每個(gè)樣本的OTU信息，使用R語(yǔ)言vegan與ggplot2等軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算NMDS分析和作圖?；诿總€(gè)樣本的OTU信息，使用R語(yǔ)言進(jìn)行PCA統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

不同組之間的顯著性差異通過(guò)進(jìn)行 One way ANOVA 進(jìn)行判斷(t檢驗(yàn))，利用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行以上統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05則認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

通過(guò)對(duì)24個(gè)小鼠糞便樣本的16 s rRNA基因V3-V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果總共獲得1 253 144條tags序列，平均每個(gè)樣本(52 114±41 441)條tags序列，經(jīng)過(guò)聚類分析共產(chǎn)生 391個(gè)聚類分析單元(OTU，operational taxonomic unit)，全部樣本的Good’s coverage值均大于99%，反映本次測(cè)序結(jié)果代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：24個(gè)樣本中總共發(fā)現(xiàn)9個(gè)門，15個(gè)綱，19個(gè)目，32個(gè)科，67個(gè)屬。

物種組成分析結(jié)果表明在科水平上HTP組，MTP，LTP和CK中Bradyrhizobiaceae(P=0.02)，Methylobacteriaceae(P=0.02)，Rhizobiaceae(P=0.016)，Staphylococcaceae(P=0.007)，Carnobacteriaceae(P=0.003)和Rhodobacteraceae(P=0.000473)存在明顯差異(見(jiàn)表1)。在科水平的熱圖中也顯示各組之間存在明顯差異(見(jiàn)圖1)

表1 正常組、低劑量組、中劑量組與高劑量組在科水平上的差異比較Table 1 Comparison of Family Level between Normal Group, Low DoseGroup, Medium Dose Group and High Dose Group

圖1 正常組、低劑量組、中劑量組與高劑量組的熱圖分析Fig.1 Thermographic analysis of normal group, low dose group,medium dose group and high dose group

Anosim相似性分析結(jié)果顯示HTP組與CK、LTP和MTP具有顯著差異(R值0.7111，P值0.003；R值0.7093，P值0.004；R值0.6167，P值0.008)(見(jiàn)表2)。shannon值分析結(jié)果表明HTP組群落多樣性較高(見(jiàn)圖2)。

表2 正常組、低劑量組、中劑量組與高劑量組Anosim相似性分析Table 2 Anosim similarity analysis betweennormal group,low dose group, mediumdose group and high dose group

NMDS數(shù)據(jù)分析表明HTP組與CK、LTP和MTP明顯分離(見(jiàn)圖3)，說(shuō)明HTP組與CK、LTP和MTP組相比差異明顯。PCA數(shù)據(jù)分析也表明HTP組與CK、LTP和MTP明顯分離(見(jiàn)圖4)。

圖2 正常組、低劑量組、中劑量組與高劑量組shannon值分析Fig.2 Analysis of Shannon values in normal group, lowdose group, medium dose group and high dose group

圖3 正常組、低劑量組、中劑量組與高劑量組NMDS數(shù)據(jù)分析Fig.3 Analysis of NMDS data in normal group, low dosegroup, medium dose group and high dose group

圖4 正常組、低劑量組、中劑量組與高劑量組PCA數(shù)據(jù)分析Fig.4 Analysis of PCA data in normal group, low dosegroup, medium dose group and high dose group

3 討論

近年來(lái)，植物多酚相關(guān)的產(chǎn)品保健食品、疾病預(yù)防及輔助治療領(lǐng)域已經(jīng)受到廣泛關(guān)注[6]。很多植物多酚進(jìn)入人體消化系統(tǒng)后是通過(guò)與腸道微生物相互作用而被利用的，一方面微生物可以轉(zhuǎn)化多酚類物質(zhì)使多酚發(fā)生開(kāi)環(huán)、脫甲基、脫羥基、水解、解聚還原等生化反應(yīng)從而生成新的代謝產(chǎn)物，另一方面多酚也有類似低聚糖的益生效果，可以影響腸道微生物的結(jié)構(gòu)、組成和功能[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)我們通過(guò)對(duì)24只飲用不同濃度的茶多酚的C57BL/6 J小鼠進(jìn)行腸道微生物的檢測(cè)，從而來(lái)研究茶多酚對(duì)腸道微生物的影響及作用。實(shí)驗(yàn)中shannon值分析結(jié)果表明高濃度茶多酚攝入可增加腸道菌群的多樣性，Anosim相似性分析結(jié)果也顯示了類似的結(jié)果。本結(jié)果與Liu 等人利用高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型較綠茶、烏龍茶和紅茶對(duì)高脂誘導(dǎo)紊亂小鼠腸道菌群影響結(jié)果一致[9]，可能由于茶多酚具有類似低聚糖的益生效果，影響了腸道微生物的多樣性、結(jié)構(gòu)和組成[7]。值得注意的是茶多酚需要達(dá)到一定濃度才可以有效改變腸道微生物。

另外，本研究結(jié)果表明在中劑量組和高劑量組中乳酸桿菌的含量明顯高于低劑量和對(duì)照組(P=0.038)，結(jié)果與曾婷玉等利用不同劑量的茯磚茶水提物(15.75、31.5、63 mg/day/mouse)對(duì)小鼠腸道中乳桿菌的影響結(jié)果相一致，并且本研究也顯示茶多酚對(duì)乳桿菌的增殖效果最為明顯并且呈劑量依賴性[10]。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在HTP組中Bradyrhizobiaceae， Methylobacteriaceae， Rhizobiaceae， Staphylococcaceae， Carnobacteriaceae和Rhodobacteraceae含量明顯升高。因而可以推測(cè)，茶多酚具有可以增加腸道微生物的多樣性，增加益生菌的比例及改變菌群組成的功能。