戚家明 楊娜 孫杉杉 明艷超 郭亮 張東旭 徐志文

（1. 河北省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心，秦皇島 066004；2. 河北省農(nóng)業(yè)廳植物營養(yǎng)與海洋功能肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，秦皇島 066004；3. 領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司，秦皇島 066004）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）屬于芽孢桿菌屬，是一種好氧革蘭氏陽性菌，表面生有鞭毛。在土壤和植物根際中枯草芽孢桿菌是優(yōu)勢種群，其可以產(chǎn)生芽孢在極端環(huán)境中長期存活，是一種植物根際的有益微生物，可以通過分泌拮抗物質(zhì)和競爭作用防治植物病害［1］。

早期對枯草芽孢桿菌近緣種群的分類與鑒定主要是根據(jù)菌株的形態(tài)特征和生理生化特征進(jìn)行區(qū)分如通過菊粉、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸等試驗(yàn)可區(qū)分枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌［2］，但這種分類方法過程繁瑣準(zhǔn)確性差［3］，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，具有高分辨率及穩(wěn)定性的基因序列分析鑒定技術(shù)逐漸成為菌株鑒定的重要手段。16S rDNA基因既具有高度保守性又具有高變性從而可以反映出不同種屬間的親緣關(guān)系，是細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和種屬鑒定的常用分類工具［4］。但枯草芽孢桿菌類群間的親緣關(guān)系較近，16S rDNA序列相似度太高從而導(dǎo)致區(qū)分度較低［5］，為了能夠有效準(zhǔn)確區(qū)分枯草芽孢桿菌種群間的親緣關(guān)系，有研究在細(xì)菌的基因組中挑選了在系統(tǒng)進(jìn)化過程中保守但又具有相對較快的變異速率的基因作為補(bǔ)充，如gyrA［6］、rpoB［7］及gyrB［8］基因等。

枯草芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面具有較大的應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)價值，有許多研究對枯草芽孢桿菌的液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高發(fā)酵水平達(dá)到產(chǎn)業(yè)化的目的［9-10］。在枯草芽孢桿菌工業(yè)發(fā)酵過程中提高發(fā)酵水平需要對接種量、pH、溶氧及消泡劑用量等一系列因素進(jìn)行嚴(yán)格控制同時要防止噬菌體污染。

在枯草芽孢桿菌BS-0的工業(yè)發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)存在活菌數(shù)驟然下降，發(fā)酵液變澄清等感染噬菌體典型現(xiàn)象，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量及產(chǎn)量，雖然經(jīng)過環(huán)境消毒以及暫停生產(chǎn)可以在短時間緩解噬菌體感染，但在連續(xù)生產(chǎn)一段時間后噬菌體感染情況再次出現(xiàn)。

相比于環(huán)境治理和添加抑制劑，篩選噬菌體抗性菌株是較為徹底的解決噬菌體感染問題的方法［11］。為了解決發(fā)酵生產(chǎn)過程中噬菌體污染問題，本研究從枯草芽孢桿菌BS-0異常發(fā)酵液中分離到2株形態(tài)不同的噬菌體S01及S02，利用這兩株噬菌體對實(shí)驗(yàn)室保藏的芽孢桿菌菌株進(jìn)行噬菌體抗性菌株篩選，對篩選得到的芽孢桿菌進(jìn)行分子鑒定確定其分類地位，并對其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：枯草芽孢桿菌菌株BS-0、其他供試芽孢桿菌BS-1、BS-2、BS-3及噬菌體S01、S02均由領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司分離并保存。BS-0、BS-1、BS-2及BS-3均為土壤中篩選到具有較好生防效果的根際微生物。

主要培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基；雙層平板培養(yǎng)基：下層培養(yǎng)基，牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖2 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂 18 g/L，pH 7.0，上層培養(yǎng)基，牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖2 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂6 g/L，pH 7.0；種子及發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，豆粉20 g/L，碳酸鈣1.5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，蛋白胨1 g/L，酵母浸粉3 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.05 g/L，pH 7.0

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離純化 參照雙層平板法［12］并改進(jìn)：取5 mL異常發(fā)酵液經(jīng)3 500 r/min 離心10 min，留取上清液并經(jīng)過0.22 μm直徑的無菌濾膜過濾除菌，取100 μL濾液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取1 mL稀釋液與3 mL培養(yǎng)至對數(shù)期前期（OD600=0.3-0.5）的枯草芽孢桿菌BS-0的菌液進(jìn)行混合，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min，融化半固體培養(yǎng)基并冷卻至45℃以下，將培養(yǎng)后的混合菌液與融化的半固體培養(yǎng)基充分混勻并立即均勻傾倒在預(yù)先準(zhǔn)備好已凝固的下層培養(yǎng)基上。經(jīng)凝固的培養(yǎng)基平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后觀察噬菌斑形態(tài)。

用滅菌牙簽分別挑取形態(tài)不同的單個噬菌斑接入對數(shù)前期的枯草芽孢桿菌BS-0菌液中，培養(yǎng)6-8 h后離心取上清液過濾除菌，得到濾液后采用上述傾倒雙層平板的方法進(jìn)行純化，次日再次挑取單個噬菌斑再次進(jìn)行該試驗(yàn)直至平板上噬菌斑形態(tài)一致。

將純化得到的噬菌體接入對數(shù)前期BS-0的菌液中，培養(yǎng)10-12 h后離心留取上清液，上清液過濾除菌后即為單一噬菌體原液，放置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 保藏菌株的噬菌體抗性篩選 保藏菌株進(jìn)行劃線活化后挑取單菌落接于液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取梯度稀釋后的噬菌體溶液1 mL分別與3 mL菌液混勻傾倒雙層平板，過夜培養(yǎng)觀察是否出現(xiàn)噬菌斑。

1.2.3 噬菌體抗性菌株的分子鑒定 將篩選到的噬菌體抗性菌株從保藏的甘油管中接出進(jìn)行劃線培養(yǎng)，挑取單菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司北京測序部，對該菌的16S rDNA和gyrA基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果分別提交至ezbiocloud.net數(shù)據(jù)庫及NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，利用MEGA 7.0.26軟件Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 枯草芽孢桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.2.4.1 發(fā)酵種子液的制備 將菌株從保藏的甘油管中接于平板中進(jìn)行活化，用接種環(huán)從平板中挑取一環(huán)接于500 mL種子液培養(yǎng)基（成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同）中，30℃ 170 r/min培養(yǎng)至對數(shù)前期。

1.2.4.2 分批發(fā)酵工藝 使用15 L發(fā)酵罐（鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司制造），500 mL種子液接入裝有9 L培養(yǎng)基的15 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵過程中由溶氧電極（瑞士梅特勒公司制造）測定發(fā)酵液中溶氧值，pH值由pH電極（瑞士梅特勒公司制造）測定。發(fā)酵期間的參數(shù)控制：初始pH、通氣量及攪拌轉(zhuǎn)速分別為7.0、2 L/min及150 r/min，發(fā)酵期間調(diào)整通氣量及攪拌轉(zhuǎn)速控制溶氧在30%以上，溫度恒定保持在37℃，泡沫較多時流加消泡劑消除泡沫。

1.2.4.3 流加發(fā)酵工藝 前期發(fā)酵參數(shù)同分批發(fā)酵，后期分別采取以下2種方式流加葡萄糖：（a）初始糖濃度為10 g/L，當(dāng)發(fā)酵液中糖濃度低于5 g/L時，按照3g/L·h的速度流加葡萄糖，補(bǔ)加量10 g/L。（b）初始糖濃度為15 g/L，當(dāng)發(fā)酵液中糖濃度低于5 g/L時，按照2 g/L·h的速度流加葡萄糖，補(bǔ)加量10 g/L。

1.2.5 發(fā)酵過程中生物量的測定 采用平皿涂布計數(shù)法［13］。

1.2.6 葡萄糖含量測定 SBA-40C生物傳感分析儀測定。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體分離及原液制備

枯草芽孢桿菌BS-0發(fā)酵液經(jīng)雙層平板法分離后出現(xiàn)2種形態(tài)不同的噬菌斑，分別將其命名為S01及S02（圖1）。噬菌體S01產(chǎn)生邊緣清晰半透明、中心全透明的同心圓形噬菌斑，內(nèi)徑1.1 mm、外徑2.9 mm，噬菌體S02產(chǎn)生邊緣清晰半透明圓形噬菌斑直徑1.7 mm，并按照方法1.2.1制備噬菌體原液。

圖 1 S01及S02形成的噬菌斑

2.2 噬菌體抗性菌株篩選

為了篩選噬菌體抗性菌株，從實(shí)驗(yàn)室的芽孢桿菌菌種庫中選取了具有較好生防效果的3株芽孢桿菌（BS-1、BS-2和BS-3）進(jìn)行噬菌體抗性篩選。將噬菌體S01及S02的原液按照1∶1的比例混合均勻進(jìn)行復(fù)合侵染，以原始菌株BS-0作為對照。如圖2所示，芽孢桿菌BS-0、BS-1及BS-3均出現(xiàn)了明顯的噬菌斑，而芽孢桿菌BS-2并未出現(xiàn)噬菌斑，這表明噬菌體S01及S02無法侵染BS-2。

圖2 噬菌體抗性菌株篩選

芽孢桿菌BS-2在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時并未出現(xiàn)活菌數(shù)驟然下降發(fā)酵液變澄清等噬菌體感染現(xiàn)象，如圖3所示，對結(jié)束培養(yǎng)時的發(fā)酵液進(jìn)行噬菌體分離，以原始菌株BS-0作為對照，在發(fā)酵液中不存在噬菌體感染情況。

圖3 BS-2發(fā)酵液中噬菌體檢測

2.3 菌株BS-2的分子生物學(xué)鑒定

在前面的實(shí)驗(yàn)中我們得到了一株枯草芽孢桿菌的噬菌體無法侵染的芽孢桿菌BS-2，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)及生理生化特征我們僅能將BS-2鑒定到枯草近緣種群，無法準(zhǔn)確鑒定BS-2為枯草芽孢桿菌，故對芽孢桿菌BS-2進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定確定其分類地位。

2.3.1 基于16S rDNA 序列比對結(jié)果的系統(tǒng)進(jìn)化分析 芽孢菌BS-2的16S rDNA基因片段序列長度為1 421 bp，GenBank登錄號為 MH469709。將測序得到的序列提交至ezbicloud.net數(shù)據(jù)庫與已知模式菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對。選取同源性高于99%的菌株序列利用MEGA7軟件鄰位連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（相似度重復(fù)計算1 000次）。芽孢菌BS-2基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。根據(jù)比對結(jié)果與菌株BS-2同源性高于99%的菌株均為芽孢桿菌屬，可以確定BS-2為芽孢桿菌屬，但根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹無法準(zhǔn)確鑒定BS-2到種。

2.3.2 基于gyrA基因序列 BLAST 結(jié)果的系統(tǒng)進(jìn)化分析 由于根據(jù)16S rDNA 序列比對結(jié)果的系統(tǒng)進(jìn)化分析無法準(zhǔn)確鑒定BS-2到種，故又對芽孢桿菌BS-2的gyrA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。芽孢菌BS-2的gyrA基因片段序列長度為729 bp，GenBank登錄號為MH479013。將測序得到的gyrA基因序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST分析，得到Ident和Query cover均大于99%的結(jié)果100個，其中95個為枯草芽孢桿菌，選擇其中13株菌的gyrA序列，同時根據(jù)16S rDNA比對結(jié)果選取其中4株同源性較高的芽孢菌的gyrA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。根據(jù)NCBI比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹，可以準(zhǔn)確將菌株BS-2鑒定為枯草芽孢桿菌。

2.4 葡萄糖流加方式對BS-2發(fā)酵的影響

圖4 基于16S rDNA序列比對結(jié)果構(gòu)建的菌株BS-2的系統(tǒng)發(fā)育樹

利用15 L發(fā)酵罐對枯草芽孢桿菌BS-2進(jìn)行液體發(fā)酵，采取方法1.2.4.2所描述的分批發(fā)酵方式和方法1.2.4.3描述的2種不同的補(bǔ)料方式流加葡萄糖，每隔4 h收取發(fā)酵液樣品進(jìn)行生物量測定及葡萄糖含量測定。液體發(fā)酵期間發(fā)酵液中生物量變化曲線，如圖6所示。

液體發(fā)酵期間發(fā)酵液中葡萄糖濃度變化曲線如圖7所示。三種發(fā)酵方式的發(fā)酵結(jié)果統(tǒng)計如表1所示。

根據(jù)分批發(fā)酵生物量變化曲線，枯草芽孢桿菌BS-2發(fā)酵呈現(xiàn)以下特點(diǎn)：在0-4 h，處于延遲期，菌體生長緩慢葡萄糖消耗較慢，4-8 h出現(xiàn)第一個生長高峰，隨后8-12 h菌數(shù)下降，12-16 h出現(xiàn)第二個生長高峰，16-20 h開始出現(xiàn)芽孢，菌數(shù)再次下降并在第20 h時芽孢率大于90%結(jié)束培養(yǎng)。分批發(fā)酵的初始糖濃度為25 g/L，推測該糖濃度顯著高于枯草芽孢桿菌BS-2生長的最適糖濃度從而抑制其生長，故降低初糖濃度，并在發(fā)酵液中葡萄糖濃度低于5 g/L時進(jìn)行補(bǔ)料。

圖5 基于gyrA序列比對結(jié)果構(gòu)建的菌株BS-2的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 枯草芽孢桿菌BS-2發(fā)酵曲線

流加補(bǔ)料與分批發(fā)酵相比在發(fā)酵前期0-12 h中并未出現(xiàn)菌數(shù)先下降后上升的現(xiàn)象，流加補(bǔ)料發(fā)酵過程中0-8 h處于延遲期，8-16 h菌體開始生長，16 h達(dá)到補(bǔ)料點(diǎn)進(jìn)行流加補(bǔ)料，16-20 h開始快速生長在20 h達(dá)到最大值，第24 h芽孢率達(dá)到90%結(jié)束培養(yǎng)。結(jié)果顯示初糖濃度25 g/L對于BS-2生長確實(shí)具有一定的抑制作用，在降低初糖濃度后，發(fā)酵周期延長，葡萄糖利用率及生物量顯著提升。

圖7 枯草芽孢桿菌BS-2發(fā)酵液中葡萄糖濃度的變化

比較兩種補(bǔ)料方式，在相同葡萄糖添加量條件下，初糖濃度15 g/L時生物量和葡萄糖利用率都高于初糖濃度10 g/L的處理，初糖濃度為15 g/L時更適宜BS-2菌體生長。

3 討論

枯草芽孢桿菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中噬菌體感染對生產(chǎn)影響嚴(yán)重，相比于篩選能抑制噬菌體生長且不影響芽孢桿菌生長的抑制劑［14］及環(huán)境治理［15］等方法，篩選噬菌體抗性菌株的方法更加徹底和簡便。

表1 三種補(bǔ)料方式的發(fā)酵結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)從枯草芽孢桿菌BS-0異常發(fā)酵液中分離到以枯草芽孢桿菌為宿主菌的噬菌體S01及S02，并利用S01、S02對實(shí)驗(yàn)室芽孢桿菌庫進(jìn)行篩選，得到一株噬菌體無法侵染的芽孢桿菌BS-2，菌種庫信息顯示依據(jù)細(xì)胞形態(tài)及生理生化特征將BS-2鑒定為枯草近緣種群的芽孢桿菌，難以確定枯草芽孢桿菌的噬菌體S01、S02無法侵染BS-2的原因是BS-2并非噬菌體的宿主枯草芽孢桿菌，還是BS-2是具有噬菌體抗性的枯草芽孢桿菌。故我們對芽孢桿菌BS-2進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定以確定其分類地位。

枯草芽孢桿菌近緣種群包括莫哈維芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）、特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）、暹羅芽孢桿菌（Bacillussiamensis）及解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）等，在近緣種群內(nèi)利用傳統(tǒng)的生理生化指標(biāo)及16S rDNA序列比對等手段無法進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分［16］，近年來在枯草芽孢桿菌分類的研究中發(fā)現(xiàn)有很多基因可以作為近緣種的分類工具且具有良好的區(qū)分度。有研究人員對枯草群內(nèi)菌株的gyrA基因進(jìn)行了測序［17］，發(fā)現(xiàn)該基因具有較大的差異。相似性最高的兩個種莫哈維芽孢桿菌與深褐芽孢桿菌間gyrA基因相似度僅為95.8%，在枯草群內(nèi)的菌株具有較好的區(qū)分度［18］。根據(jù)BS-2 16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹無法將BS-2與枯草群內(nèi)近緣種準(zhǔn)確區(qū)分，故又結(jié)合gyrA基因再次進(jìn)行鑒定，最終確定BS-2為枯草芽孢桿菌，同時也證明枯草芽孢桿菌BS-2具有噬菌體抗性。

在搖瓶優(yōu)化的基礎(chǔ)上利用15 L發(fā)酵罐優(yōu)化枯草芽孢桿菌BS-2的發(fā)酵工藝。進(jìn)行分批發(fā)酵時出現(xiàn)了菌數(shù)先下降后上升的現(xiàn)象且最終發(fā)酵水平較低，過高的葡萄糖濃度對菌株的生長會有抑制作用［19］，且流加發(fā)酵的工藝可以大幅度提高發(fā)酵水平［20］，故降低初糖濃度并采取流加葡萄糖補(bǔ)料的方式進(jìn)行發(fā)酵。根據(jù)發(fā)酵過程中生物量變化曲線，流加補(bǔ)料發(fā)酵在8-16 h中菌數(shù)持續(xù)增長，并且在16 h發(fā)酵液中葡萄糖濃度低于5 g/L時開始補(bǔ)加葡萄糖，16-20 h生長速度進(jìn)一步加快，并且整個發(fā)酵時間延長4 h。最優(yōu)的流加補(bǔ)料發(fā)酵方式下，葡萄糖利用率和菌體產(chǎn)量分別是分批發(fā)酵條件下的1.24倍和3.98倍。流加補(bǔ)料的方式解決了分批發(fā)酵中葡萄糖濃度較高抑制生長的問題，并且延長了菌株生長的時間，提高了葡萄糖利用率及發(fā)酵水平，葡萄糖初始濃度過高或過低都無法得到較高的生物量。

4 結(jié)論

從異常發(fā)酵液中分離到兩株噬菌體S01及S02，利用噬菌體對實(shí)驗(yàn)室保藏的芽孢桿菌菌株進(jìn)行篩選得到一株噬菌體無法侵染的芽孢桿菌BS-2，結(jié)合16S rDNA及gyrA基因序列可以確定BS-2為枯草芽孢桿菌，且其具有噬菌體抗性。經(jīng)過發(fā)酵工藝優(yōu)化，在15 L發(fā)酵罐培養(yǎng)中采取流加補(bǔ)料的方式，枯草芽孢桿菌BS-2發(fā)酵水平可以達(dá)到2.43×1010CFU/mL。具有噬菌體抗性的枯草芽孢桿菌BS-2可以達(dá)到較高的發(fā)酵水平，具有較強(qiáng)的工業(yè)化應(yīng)用潛力。

致謝：本研究得到河北省產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)（169A76114H）的資助及河北省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心李麗艷、王東、揣峻峰和周立華等同志的大力協(xié)助，在此對他們不遺余力的幫助表示感謝。