肖冰 劉榜 羅云波，3 黃昆侖，3 張園 李夏瑩 張秀杰許文濤，3 周翔

（1. 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2. 華中農業(yè)大學農業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；3. 農業(yè)農村部農業(yè)轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083；4.農業(yè)農村部科技發(fā)展中心，北京 100122）

目前待檢物質種類繁多，樣品復雜［1-2］，針對不同待檢物質的定量檢測方法不一［3］。各種傳統(tǒng)定量檢測方法可以準確測定目標檢測物的含量［4-5］，但無法對不同種類的待檢物質進行統(tǒng)一的檢測，而功能核酸的出現(xiàn)與其相關技術的發(fā)展可有效的解決這一問題。功能核酸作為一類具有特定空間構象、執(zhí)行特異生物功能的天然或者人工核酸序列，可以將各種待檢物質統(tǒng)一轉化為核酸信號再結合功能核酸相關檢測方法進行檢測。另外，還具有易于修飾、價格低廉、穩(wěn)定性高、特異性強等優(yōu)勢。功能核酸檢測技術分為靶標識別、信號轉換輸出兩部分。信號輸出的方式包括比色信號、熒光信號、電化學信號、化學發(fā)光信號、熱信號和動力學信號等。

其中，熒光傳感具有靈敏度高、特異性強以及可進行實時原位檢測的優(yōu)勢，而功能核酸免標記型熒光傳感技術是熒光傳感中重要的一部分，該技術與非功能核酸普通熒光傳感技術以及標記型熒光傳感技術相比都具有諸多優(yōu)勢。其與非功能核酸普通熒光傳感技術相比，功能核酸起到了十分重要的作用，同時，為該種技術帶來諸多優(yōu)勢。主要體現(xiàn)在3個方面。一是可將多種靶物質統(tǒng)一轉為較為穩(wěn)定的核酸信號，使現(xiàn)有的熒光檢測的可檢靶物質種類增多，擴大檢測范圍；二是由于功能核酸本身可擴增的性質，可以在定量檢測中加入信號擴增，使得檢測靈敏度以及檢測效率大大增強；三是根據(jù)不同熒光物質的特性，與不同熒光物質結合，使體系產生熒光信號的變化。另外，與標記型熒光傳感技術相比，其具有免去標記過程的優(yōu)勢，具體來看，該技術中的熒光物質可以在檢測中免去熒光標記時熒光、猝滅基團的篩選和標記過程的繁瑣和成本，同時，由于其自身的特性，可以保證與核酸的特異或非特異性結合后產生熒光信號變化。這也進一步擴展熒光檢測的檢測范圍，同時更擴大和增強了其檢測靈敏度與檢測效率［6-7］，該技術也逐漸被廣泛應用于食品安全、環(huán)境污染、疾病診斷相關多種靶標物質的檢測［8］。

不同熒光物質與功能核酸形成熒光信號機制復雜，種類繁多。因此，本文首先針對幾種重要熒光物質的特點以及其與多種功能核酸的分子識別、作用方式以及熒光發(fā)光機制進行詳細的介紹，并據(jù)此將功能核酸熒光免標記型定量統(tǒng)一化檢測技術分為富G功能核酸序列介導的熒光定量檢測技術，單鏈功能核酸序列介導的熒光定量檢測技術，雙鏈功能核酸序列介導的熒光定量檢測技術，適配體功能核酸序列介導的熒光定量檢測技術。接著從這幾個角度對功能核酸熒光免標記型定量統(tǒng)一化檢測技術與其實際應用進行了分類介紹與評價對比，最后討論了該技術在多種風險因子分析中的研究意義以及存在的問題，并為其未來的發(fā)展方向與應用前景作出展望。

1 功能核酸熒光免標記型定量統(tǒng)一化檢測技術概述及其分類

功能核酸熒光免標記型定量統(tǒng)一化檢測技術的檢測基礎技術是熒光定量檢測技術，這是一種以紫外或可見光作為激發(fā)光源，照射處于基態(tài)的分子，使其吸收能量，躍遷至激發(fā)態(tài)，進而由于激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，激發(fā)態(tài)物質分子返回基態(tài)過程會散失部分能量，這部分能量轉化為光能，這種光被稱為熒光，即可用與檢測的熒光信號［9-10］。熒光定量檢測技術廣義上是由識別部分、轉化部分以及熒光輸出部分構成，其檢測原理是待檢測物被識別部分與轉化部分特異性識別、結合、相互作用并轉化為可引起熒光物質敏感的信號［11］，進而導致其光物理性質發(fā)生變化，主要包括熒光的增強、淬滅和光譜位移等。

通常，在熒光免標記型功能核酸介導的熒光定量檢測系統(tǒng)的構建過程中，需要根據(jù)反應過程中產生的不同結構的功能核酸選擇不同種類的熒光物質，這類熒光物質可以分為與G-四連體功能核酸結合的NMM，TPM類熒光物質、與單鏈功能核酸結合的SYBR Gold、SYBR Green II類熒光物質、與雙鏈功能核酸結合的SYBR Green I、YOYO、TOTO類熒光物質，與適配體功能核酸結合的Malachite Green類熒光物質。這些熒光物質在生物傳感過程中作為熒光探針起到可與不同結構的核酸進行識別的作用以及體系熒光信號報告等功能，再根據(jù)其熒光發(fā)光特點可以將熒光免標記型功能核酸介導的熒光生物傳感技術分為富G功能核酸序列介導的熒光定量檢測技術，單鏈功能核酸序列介導的熒光定量檢測技術，雙鏈功能核酸序列介導的熒光定量檢測技術，適配體功能核酸序列介導的熒光定量檢測技術等。

2 免標記熒光定量檢測技術重要發(fā)光機制及其與核酸結合的典型應用

2.1 聚集誘導發(fā)光

基于聚集誘導發(fā)光（Aggregation-Induced Emission，AIE）的熒光分子是一類含螺旋結構的分子，具有游離狀態(tài)不發(fā)熒光，聚集狀態(tài)或固態(tài)發(fā)較強熒光的性質［12］。具體發(fā)光機理是當這類分子以單體游離態(tài)被激發(fā)光激發(fā)后，被激發(fā)電子不以輻射躍遷的形式，而以分子內振動旋轉形式回到基態(tài)，無法釋放多余能量，不產生熒光；而當該類分子聚集時，被激發(fā)的電子無法通過分子內振動旋轉釋放能量回到基態(tài)，而是通過輻射方式釋放多余能量，產生熒光。AIE 分子由于其獨特的發(fā)光體系已經成為了一種強有力的分析工具，它可以很巧妙的結合分子溶解性，應用于設計高靈敏度和高選擇性的生物熒光探針和生物化學傳感器的設計，與傳統(tǒng)的熒光探針相比，AIE探針具有更優(yōu)越的抗漂白能力和更高的可靠性等的特點［13］。另外，該類核酸探針不需要標記淬滅基團或者輔助基團，一條簡單的免標記核酸探針便可高效地完成對目標物的檢測，極大地簡化了傳統(tǒng)核酸探針的結構，降低探針的設計、合成成本及操作難度。

Zhuang和 Lou 等［14］設計了一種基于 AIE 效應的免標記核酸探針，用于檢測單細胞體系和病人組織樣本中端粒酶活性。無端粒酶時，端粒酶引物帶有負電荷與帶有正電荷的AIE 分子通過靜電作用力，形成復合物，此時AIE 分子以分散態(tài)存在，熒光較弱；有端粒酶時，端粒酶引物以重復片段擴增，擴增后產物可與大量AIE 分子結合，形成復合物，使得AIE 分子聚集，熒光信號增強。通過監(jiān)測AIE 分子熒光信號的變化，實現(xiàn)對單細胞體系和病人組織樣本中的端粒酶活性檢測（圖1-A）。

2.2 熒光共振能量轉移

熒光共振能量轉移原理（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）是一種應用較為普遍的熒光發(fā)光機制，在FRET體系中含有能量供體與能量受體兩個熒光基團，供體被激發(fā)光所激發(fā)后可以向受體轉移能量，激發(fā)受體發(fā)出熒光［15］，熒光共振能量轉移機理對供體和受體的激發(fā)和發(fā)射光譜、兩者間的距離和排列方式皆有一定要求［16］。

基于此原理，Zhuang 等［17］利用游離的AIE熒光分子與猝滅基團之間的FRET作用，設計了檢測端粒酶活性的熒光傳感器。無端粒酶時，引物無法擴增，帶有正電荷的AIE 分子與核酸分子通過靜電作用力結合，形成穩(wěn)定的復合物，此時AIE 分子聚集狀態(tài)弱，且AIE 分子與淬滅基團非常臨近，AIE分子的熒光被淬滅；有端粒酶時，引物以重復片段擴增［18］，擴增片段會繼續(xù)與AIE 分子通過靜電作用力結合，形成穩(wěn)定的復合物，此時AIE 分子以聚集狀態(tài)存在，且遠離淬滅基團，此時AIE 分子發(fā)射熒光，通過監(jiān)測AIE 分子熒光信號變化，實現(xiàn)在單細胞體系中檢測端粒酶活性（圖1-B）。在單細胞成像時，該研究方法大大降低了背景熒光信號干擾，增加了檢測方法的可靠性。同時，該課題組［19］在端粒酶引物標記淬滅基團可降低背景熒光信號干擾的基礎上，還利用最大發(fā)射波長為藍光波段的AIE 分子和紅光波段的AIE 分子彼此之間可產生FRET 現(xiàn)象，實現(xiàn)在單細胞體系中檢測端粒酶活性，大大拓寬檢測范圍。

2.3 靜電力作用

在該種機制下的熒光傳感體系中，熒光物質分子與目標分子之間存在靜電作用力，在這種靜電作用力的介導下，靶物質信號變化可以引起熒光分子數(shù)量，狀態(tài)，強弱的改變，達到檢測目的。Qian 等［20］以多孔硅納米粒子（MSN）為載體，在MSN 孔道內共價固定熒光淬滅劑BHQ并且填充熒光素，另外，通過靜電吸附在其表面包裹含有端粒酶底物片段的DNA 鏈，可將熒光素封堵在孔道內。在端粒酶的作用下，端粒酶引物擴增，導致探針擴增產物的兩端雜交形成環(huán)狀結構而脫離MSN 表面，從而打開孔道，釋放熒光素，此時熒光素遠離淬滅劑BHQ，因此發(fā)射熒光。通過檢測熒光信號變化，實現(xiàn)在細胞內端粒酶活性的檢測（圖1-C）。

2.4 水溶性共軛聚合物發(fā)光

共軛聚合物是一種由多個重復發(fā)光單元通過彼此間的共軛作用而形成的一類具有特殊光電性質的高分子化合物。共軛聚合物具有獨特電子結構，每個發(fā)光單元之間通過電子離域與電子耦合使其具有分子線效應. 具體來講，當具有強光捕獲能力的共軛聚合物受激發(fā)后，產生的激子可以沿著π電子骨架快速傳遞至能量受體，從而將環(huán)境中的微小波動轉換為共軛聚合物熒光信號的變化，進而實現(xiàn)對被檢測物的高靈敏檢測［21-22］。另外，通過對其結構的精準調控，可以獲得具有不同性能的功能性分子。其中，通過改變其主鏈結構，可以獲得具有不同吸收和發(fā)射波長的熒光探針；通過對側鏈結構修飾以水溶性基團成為水溶性共軛聚合物和/或修飾選擇性識別分子實現(xiàn)與特定靶標間的靜電作用或者特異性結合，進而實現(xiàn)選擇性識別的目的.

He等［23］將單鏈DNA作為識別載體，用水溶性共軛聚合物P1（圖1-D）實現(xiàn)在水溶液中對鉀離子檢測，該策略中還利用熒光共振能量轉移（FRET）原理以及鉀離子能夠誘導單鏈DNA形成G-quadmplex結構的特點，當含有熒光基團標記的DNA溶液中不存在鉀離子時，單鏈DNA呈無規(guī)則螺旋構象，空間電荷密度低。當向溶液中加入鉀離子時，單鏈DNA會折疊呈G-quadruplex構象，此時空間電荷密度大大增加。因此，可通過靜電相互作用縮短聚合物與核酸鏈之間的距離，使聚合物與核酸上標記的熒光團之間能夠發(fā)生有效的熒光共振能量轉移，從而實現(xiàn)對鉀離子高選擇性的識別，其他離子如Na、Li 及NH4+等對檢測基本沒有干擾。

2.5 時間分辨熒光

時間分辨熒光是一種特殊的熒光現(xiàn)象，也是一種基于分子吸收光能后以光輻射形式去活化的過程。其基本原理是Frank-Condon規(guī)則，分子中處于單線態(tài)基態(tài)電子能級 S0的電子吸收一定波長的光子后，被激發(fā)至單線態(tài)激發(fā)態(tài)電子能級中的某一振動能級（一般是 S1態(tài)），這一過程約10-15 s；在經歷短暫的振動弛豫（Vibration relaxation）過程后（約10-12-10-10s）會有大量電子在S1態(tài)的最低振動能態(tài)積累。時間分辨熒光則是在最后將能量轉移到鑭系元素復合物的中心離子，通過其 4f-4f能量躍遷而發(fā)出特定的熒光。再利用光學儀器檢測熒光發(fā)射的強度隨時間的變化，即可得到體系的熒光壽命信息。

一種基于鑭系元素銪復合物與碳納米管的的新型無標的時間分辨熒光傳感器被設計用于溶解酶的檢測。在該緩沖體系中，長為42個堿基的適配體核酸單鏈呈游離狀態(tài)，單壁碳納米管則呈現(xiàn)聚集的狀態(tài)，當其與核酸適配體單鏈結合時被分散，通過π-π堆積相互作用，結合 Eu3/BHHT復合物并猝滅其熒光；當溶菌酶存在時，由于其核酸適配體與它的較高的親和力和選擇性，兩者結合，無法在與單壁碳納米管結合，Eu3/BHHT復合物被釋放，熒光恢復。在最優(yōu)的條件下，該傳感器的檢測限可以達到0.9 nmol/L，比普通適配體傳感器檢測限低60倍［24］（圖1-E）。

3 功能核酸熒光免標記型定量統(tǒng)一化檢測技術與其實際應用

3.1 富G功能核酸序列介導的熒光免標記型定量統(tǒng)一化檢測技術

G-四鏈體結合型熒光定量檢測技術是一類選用可與G-四鏈體核酸結構結合的核酸熒光染料的免標記型功能核酸熒光定量檢測技術。利用其進行檢測時，隨著目標物的加入，核酸發(fā)生G-四鏈體結構化或去結構化的改變，影響核酸染料與核酸結合，從而引起熒光信號發(fā)生變化。該類核酸熒光染料通常是核酸嵌入型染料或納米簇等，主要包括三苯甲烷類染料（TPM）［25］、N-甲基卟啉二丙酸 IX（NMM）［26］、styryl quinolinium（SQ）［27］、PPIX［28］等。目前將熒光染料與G-四鏈體相結合的熒光定量檢測技術已被廣泛應用。

圖1 聚集誘導發(fā)光（A）熒光共振能量轉移（B）靜電力作用介導（C）水溶性共軛聚合物介導（D）時間分辨熒光（E）機理圖

Guo［29］和 Lu等［30］設計了兩種基于 G-四鏈體能夠極大提高TPM染料和SQ染料熒光強度的分別用于檢測銀離子與半胱氨酸的功能核酸熒光傳感器。其檢測機理是自由態(tài)的TPM染料和SQ染料發(fā)出極其微弱的熒光而結合G-四鏈體后熒光強度大大增強，但是，當加入銀離子后，由于鳥嘌呤的作用，將會破壞G-四鏈體與熒光染料的配合物結構，從而導致熒光下降；而半胱氨酸（Cys）能與銀離子作用，因而加入Cys時，銀離子被Cys從富G寡核苷酸鏈置換出來，G-四鏈體重新形成，TPM或SQ染料熒光強度恢復，通過這種銀離子與半胱氨酸的交替加入實現(xiàn)對G-四鏈體的破壞與熒光強度的改變，進而達到雙重檢測的目的（圖2-A）。Guo等設計了一條32個堿基一條24個堿基的核酸單鏈探針，加完樣品后需要將體系混合30 min后進行激發(fā)波長為605 nm，發(fā)射波長為680 nm的熒光檢測，實驗中銀離子檢測的線性范圍為0.5-13 nmol/L，檢測限可達到80 nmol/L。Lu等設計的核酸序列長度為28個堿基序列，與SQ染料呈現(xiàn)較好的熒光增強效果。

另外，部分G-四鏈體功能核酸的形成需要金屬離子的誘導，金屬離子誘導G-四鏈體功能核酸結合型熒光定量檢測技術主要分為兩類，一類借助金屬離子誘導核酸單鏈形成G-四鏈體，進而與核酸熒光染料結合引起熒光信號增強或金屬離子與核酸染料競爭結合G-四鏈體，破壞原染料與G-四鏈體結合狀態(tài)，引起熒光信號減弱的免標記型功能核酸熒光定量檢測技術。該類熒光傳感器較為巧妙的應用于金屬離子檢測，其中G-四鏈體也是金屬離子的特異性配體。該類核酸熒光染料主要包括硫磺素T［31］（Thioflavin T），噻唑橙（TO）等。

TO單體時熒光強度較低，可與鋅離子誘導G-四鏈體配合物結合，熒光增強。利用該種染料可設計另一類金屬離子誘導G4結合型熒光定量檢測技術，即借助金屬離子誘導核酸單鏈形成G-四鏈體，進而與核酸熒光染料結合引起熒光信號增強的熒光傳感器。2015年，Guo［32］和他的團隊設計了一種針對鋅離子檢測的免標記熒光定量檢測技術，其檢測限可達 0.71 μmol/L，在 0-30 μmol/L，呈線性相關。該傳感器設計時，噻唑橙作為熒光探針，這段探針是一段含有20左右個堿基的核酸序列，檢測環(huán)境為10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5），室溫檢測，TO可與鋅離子誘導形成的G-四鏈體進行結合，而氧化石墨烯則用于減弱噻唑橙/功能核酸檢測系統(tǒng)的熒光背景。當鋅離子不存在時，單鏈適配體被氧化石墨烯所吸附，體系呈低熒光狀態(tài)；然而當鋅離子存在時，鋅離子誘導核酸單鏈形成G-四鏈體，并使其與氧化石墨烯分離，TO進而與鋅離子誘導形成的G-四鏈體結合，熒光強度顯著增強。

3.2 單鏈功能核酸序列介導的熒光免標記型定量統(tǒng)一化檢測技術

單鏈核酸熒光染料結合型熒光定量檢測技術是一類基于可與單鏈核酸結合的熒光染料的免標記型功能核酸熒光定量檢測技術。其基本原理是當核酸分子構型為非單鏈構型時，熒光染料成游離狀態(tài)，熒光較弱；反之，變?yōu)閱捂溄Y構時，熒光染料分子與單鏈核酸結合，熒光強度大大增強?？捎糜谔禺愋缘臋z測可與單鏈核酸的形成有關的目標靶物質。該類核酸熒光染料通常是核酸嵌入型染料，主要包括 SYBR Gold［33］、SYBR Green II［34］等。

SYBR Gold、SYBR Green II屬 于 1995年 由Molecular probes公司推出的SYBR 系列熒光染料。SYBR 系列熒光染料本質是一種非對稱花菁類化合物，與核酸具有極高親和力，同時具有高靈敏度的特性，自推出后在國內外實驗中被受推崇并已很大程度的商業(yè)化。SYBR Gold、SYBR Green II主要在核酸檢測中作為核酸凝膠染色試劑，用于RNA或DNA單鏈的染色，SYBR Green II其在紫外激發(fā)光激發(fā)下發(fā)出亮綠色，SYBR Gold發(fā)出顯眼的亮金黃色。其單體在水溶液中的熒光強度很弱，但是當與單鏈核苷酸相互作用時，可觀察到明顯增強的熒光信號。具有高靈敏性、信噪比高、使用方便、成本低等優(yōu)點。

圖2 免標記型功能核酸介導的熒光定量檢測技術原理圖

Xu 等［35］報道了一種針對葉酸受體蛋白的熒光傳感器，該傳感器基于葉酸受體蛋白對核酸鏈的保護作用和SYBR Gold可結合單鏈的特點進行設計，設計了一條含有27個堿基的3'末端標記葉酸的單鏈DNA，檢測條件為50 μL，20 mmol/L Tris-HCl，3 mmol/L MgCl2，50 mmol/L NaCl（pH 7.5），加入ExoI酶后作用25 min，室溫。沒有目標待測物時，ExoI會將核酸單鏈切割，SG染料不與單個堿基結合，熒光強度較弱；當目標蛋白加入時，與葉酸結合，葉酸蛋白與葉酸的結合物可保護核酸單鏈不被ExoⅠ所切割，保持單鏈狀態(tài)，進而結合熒光染料，使體系熒光信號增強，檢測限可以達到30 pmol/L，熒光激發(fā)波長為494 nm，發(fā)射波長為500-600 nm（圖 2-C）。

3.3 雙鏈功能核酸序列介導的熒光免標記型定量統(tǒng)一化檢測技術

雙鏈結合型熒光定量檢測技術是一類基于可與雙鏈核酸結合的熒光染料的免標記型功能核酸熒光定量檢測技術。其基本原理是當核酸分子構型為非雙鏈構型時，熒光染料成游離狀態(tài)，熒光較弱；反之，變?yōu)殡p鏈結構時，熒光染料分子與核酸結合，熒光程度增強，用于特異性的檢測可與雙鏈核酸的形成與穩(wěn)定有關的目標靶物質。該類核酸熒光染料通常是核酸嵌入型染料，主要包括SYBR Green I［36-37］、YOYO［38］、TOTO 等。

TOTO-3樣是一種游離態(tài)熒光較弱，而結合雙鏈核酸后熒光顯著增強的核酸嵌入型熒光染料。結合信號放大與熒光傳感理論，該種熒光染料較為廣泛的應用于雙鏈核酸相關的靶標物質檢測中。Chiang等［39］設計了一種汞離子免標記功能核酸熒光檢測技術，基于富含T堿基（33個堿基）核酸單鏈/TOTO-3熒光探針，檢測環(huán)境為5 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），當無汞離子存在時由于富T探針序列單鏈游離狀態(tài)，TOTO-3 呈現(xiàn)很微弱熒光；當向體系加入汞離子后，THg2+-T 錯配誘導富T探針序列分子內折疊形成雙鏈，此時，TOTO-3與雙鏈探針結合，熒光強度顯著增加（大于265倍）。該方法可在15 min內完成檢測，靈敏度0.6 ppb，并且熒光強度與汞離子濃度在一定范圍內呈線性相關。因此，可以在一定程度上實現(xiàn)離子濃度監(jiān)控，熒光激發(fā)波長為620 nm，發(fā)射波長為660 nm（圖2-B）。

3.4 適配體功能核酸序列介導的熒光免標記型定量統(tǒng)一化檢測技術

適配體熒光染料結合型熒光定量檢測技術是一類基于可與特定序列結合的熒光染料的免標記型功能核酸熒光定量檢測技術。其基本原理是當核酸分子為普通序列時，熒光染料成游離狀態(tài)，熒光較弱；而當核酸鏈序列是核酸染料的適體序列時，熒光染料分子將與單鏈核酸結合，熒光強度大大增強，可用于特異性的檢測與特定序列的產生有關的目標靶物質。該類核酸熒光染料主要包括Malachite Green、Mango等。

Xu 等［40］設計了一種針對腺苷檢測的無標記的熒光傳感器，它利用Malachite Green 與特定的DNA序列結合，產生強烈的熒光信號的原理，首先設計了一條包含有腺苷的DNA 適體序列（藍色部分）和Malachite Green的RNA 適體序列（紅色部分）的“適體鏈”，兩段適配體序列的堿基數(shù)都為27個，另一條是被稱“橋接鏈”的含有對“適體鏈”中腺苷和Malachite Green 二者的互補序列DNA 鏈（棕色部分），橋連鏈由11-16個不等的堿基組成，該檢測體系為22 mmol/L Tris 緩沖液（5.56 mmol/L NaCl，155.6 mmol/L KCl，5.56 MgCl2）?！皹蚪渔湣钡淖饔檬牵簺]有腺苷存在時，在室溫的緩沖液中，適體和橋接鏈形成穩(wěn)定的絡合物，以防止Malachite Green 適體鏈與Malachite Green 結合產生強烈的熒光信號。此時，被保留在溶液中的游離Malachite Green 幾乎沒有熒光信號。當腺苷的存在時，適體鏈與腺苷結合，留下的適體鏈與橋接鏈之間堿基互補的數(shù)量減少，此時在室溫下是不太穩(wěn)定，從而導致釋放出橋接鏈。最后，Malachite Green 與其適體鏈相結合，熒光信號明顯增強（圖2-D），該檢測中熒光激發(fā)波長為615 nm，發(fā)射波長為650 nm。

4 總結與展望

功能核酸熒光免標記型定量統(tǒng)一化檢測技術由于高靈敏度、高選擇性、高響應速度等優(yōu)點獲得迅猛發(fā)展，在化學、生命科學和環(huán)境科學等多方面具有重要的科學意義。但是就目前的研究來說仍存在一些不足，如目前的功能核酸免標型熒光傳感相關研究主要集中在一些常見物質的檢測，一些傳感策略只能實現(xiàn)在特定環(huán)境中對待特定測物檢測等，沒有做到完全的篩查和普及；部分熒光傳感系統(tǒng)的背景熒光較高，干擾檢測結果。另外，現(xiàn)在研究的生物傳感器有諸多停留在實驗理論階段，真正的商業(yè)化還需要進一步完善性能。因此，不斷探索更多、更新的型熒光物質與功能核酸的作用方式，提出新的傳感思路是將傳感檢測的特異性與靈敏度提高的有力方式，同時也是傳感技術發(fā)展的重要趨勢。同時還應在諸多方面進行改進與提高，如針對更多更廣的風險因子開發(fā)更多的功能核酸熒光免標記型定量統(tǒng)一化檢測技術，不斷拓展檢測范圍；在功能核酸熒光免標記型定量統(tǒng)一化檢測技術涉及的分子識別方式、核酸擴增技術以及熒光信號輸出機制方面進行不斷的探索和優(yōu)化，降低檢測系統(tǒng)的背景干擾，優(yōu)化性能。另外，開發(fā)高靈敏、高特異性、重復性好、便攜式的實時定量原位檢測的生物傳感器以及設計多種風險因子可同時檢測的高通量功能核酸熒光免標記型定量統(tǒng)一化檢測技術也是其另一個重要的發(fā)展趨勢。