仿刺參膠原蛋白多肽對Ⅱ型糖尿病小鼠腎臟的保護機制

韓姣姣 李妍妍 周 君 蘆晨陽 李 曄 張凌芷 蘇秀榕*（ 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江寧波5 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江寧波5 阿卜杜拉國王科技大學(xué) 吉達(dá)，沙特阿拉伯王國）

仿刺參（Apostichopus joponicus），屬棘皮動物門（Echinodermata）、海參綱（Holothuriodea）、盾手目動物（Aspidochirota）、刺參科（Stichopodidae）、仿刺參屬（Apostichopus）[1]。近代科學(xué)研究表明，刺參體內(nèi)含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如膠原蛋白、多肽、皂苷以及微量元素等，具有多種生理功能[2-7]。仿刺參膠原蛋白和多糖主要存在于體壁中，對調(diào)控人的生理功能具有重要的意義，其主要的生理活性表現(xiàn)在抗氧化、抗腫瘤、抗血脂、抗血栓等。

糖尿病腎?。―iabeticnephropathy，DN）是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，在糖尿病患者中20%～40%會發(fā)生腎病[8]。近年來，許多國內(nèi)外的學(xué)者研究從海洋生物中提取活性成分來治療糖尿病，如蔣鑫等[9]研究海參多糖降血脂功能，王霞等[10]研究金槍魚胰臟酶解液對糖尿病大鼠血糖和血脂的作用。有關(guān)仿刺參多肽作為預(yù)防Ⅱ型糖尿病的研究，國內(nèi)外未見報道。本文以糖尿病小鼠為對象，研究仿刺參多肽對小鼠腎臟的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

仿刺參取自寧波奉化博望水產(chǎn)養(yǎng)殖公司。瘦素基因敲除雄性db/db 小鼠【（36±2.0）g】30 只，雄性Db/m【（25±1.0）g】10 只，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。合格證號：SCXK （滬）2007-0005（編號2007000528007），仿刺參多肽為實驗室自制?？偰懝檀迹═C）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、胰島素濃度試劑盒，寧波美康生物科技有限公司；兩性電解質(zhì)、四甲基乙二胺（TEMED）、IPG 干膠條（pH 4-7）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、超純脲，美國Bio-Rad 公司；CHAPS、30%丙烯酰胺、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺、過硫酸銨（AP）、礦物油、非干擾型蛋白濃度試劑盒，索萊寶生物科技有限公司；2-D Clean-Up Kit，美國GE 公司。其它試劑為國產(chǎn)分析純級。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與飼養(yǎng) 10 只雄性Db/m 小鼠為空白對照組（C）；雄性db/db 小鼠30 只，按體重隨機分成模型組（M），陽性藥組（甲基巴多索隆CDDO-Me，9.75 mg·kg-1·d-1，ig），仿刺參多肽試驗組（S，50 mg·kg-1·d-1，ig），每組10 只?？瞻讓φ战M與模型組灌以等量去離子水。在試驗期間，所有動物自由進食、進水，室溫保持23～25 ℃，光照晝夜間隔12 h，給藥時間為10 周。每天觀察和記錄動物的行為活動，體重變化情況每隔3 d 測定1 次。

1.2.2 生理生化指標(biāo)檢測 試驗期10 周后停食，將小鼠麻醉后進行腹主動脈取血，分離血清，采用微板法測定血清中TC，TG，HDL-C，LDL-C 含量。試驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0 軟件進行單因素方差分析。

1.2.3 差異表達(dá)蛋白的篩選及其功能分析

1.2.3.1 蛋白質(zhì)的提取及純化 取1.0g 小鼠腎臟組織剪碎后放在預(yù)冷的研缽中加入液氮研磨成粉末，加入LB 裂解液（Alklysis buffer），使用前加入蛋白酶抑制劑（PMSF）充分溶解粉末后轉(zhuǎn)移到EP管中，600 W 超聲10～15 min，12 000 r/min，4 ℃離心20 min。在上清液中加入丙酮，-20 ℃沉淀過夜，12 000 r/min，4 ℃離心20 min，棄上清液，沉淀采用非干擾型蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒進行蛋白定量。

1.2.3.2 雙向電泳 選擇蛋白總量在200～250 μg之間，加水化上樣緩沖液（7 mol/L 尿素，3 mol/L硫脲，4% w/v CHAPS，64 mmol/L DTT，0.5% v/v Bio-lyte）定容至150 μL。先將膠條從-20 ℃冰箱取出并在室溫下放置1 h，將處理好的樣品加入泡脹槽中，膠條輕輕覆與其上并滴加礦物油覆蓋。20 ℃水化和等電聚焦12 h，平衡15 min，進行SDS-PAGE 垂直電泳?？捡R斯亮藍(lán)R-250 染色、脫色、掃描，圖像用PDQuest 軟件進行分析以及數(shù)據(jù)處理。選擇差異倍數(shù)大于1.5 倍且P<0.05 的斑點為差異蛋白，胰蛋白酶酶切后利用Autoflex speedTMMALDI-TOF-TOF（Bruker Dalton）質(zhì)譜儀進行分析。利用BioTools（Bruker Dalton）軟件搜索NCBI 數(shù)據(jù)庫，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對糖尿病小鼠血脂的影響

同空白對照組比較，模型組血清TC、TG 含量顯著升高 （P＜0.01），LDL-C 含量升高 （P＜0.05），HDL-C 含量降低（P＜0.05），胰島素濃度顯著升高（P＜0.01），說明本試驗造模成功。相比于糖尿病模型組，陽性藥組能夠降低血清TC（P＜0.01）、TG（P＜0.01）、LDL-C 水平 （P＜0.05），提高HDL-C 水平（P＜0.05），胰島素濃度顯著降低（P＜0.01）。試驗組能降低血清TG（P＜0.05）、LDL-C（P＜0.05）水平，提高HDL-C 水平（P＜0.05），胰島素濃度降低（P＜0.05），對TC 有降低的趨勢，但無顯著性差異。相比于糖尿病模型組，陽性藥組和試驗組均能顯著降低LDL-C/HDL-C 比值（P＜0.01）。

2.2 差異蛋白表達(dá)的篩選及功能分析

利用雙向電泳技術(shù)，分別對模型組、陽性藥組和試驗組的db/db 糖尿病小鼠的蛋白質(zhì)表達(dá)進行了比較，其蛋白圖譜如圖1所示。

經(jīng)雙向電泳分析，共有472 個蛋白斑點可以匹配，其中對照組有150 個蛋白斑點，模型組有182 個蛋白斑點，試驗組中也檢測出140 個蛋白斑點。這些蛋白等電點主要集中在4～7，分子質(zhì)量在10～130 ku 之間。將差異倍數(shù)大于1.5 倍以上（P<0.05）的蛋白點作為顯著差異蛋白（見表2）。

表2 仿刺參多肽調(diào)控II 型糖尿病鼠腎的差異蛋白質(zhì)分析Table 2 The different expression proteins on kidney of type II diabetic mice by Apostichopus joponicus polypeptide

2.3 差異蛋白的功能分析

GO 分析發(fā)現(xiàn)，試驗組中差異表達(dá)基因富集顯著的生物過程主要與蛋白轉(zhuǎn)運、 激酶活性以及電子傳遞有關(guān)，蛋白轉(zhuǎn)運過程與糖尿病之間存在某些作用，這些過程往往可以控制生物過程中關(guān)鍵蛋白的作用，從而影響整個生物過程。差異基因富集的分子功能過程主要與能量代謝以及激酶活性有關(guān)。糖尿病與許多基因之間存在廣泛的作用，這些基因中包含一些關(guān)鍵代謝酶的編碼序列，可以控制新陳代謝途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)，從而影響整個新陳代謝[11]。差異基因富集的細(xì)胞組分中與非膜結(jié)合細(xì)胞器、大分子復(fù)合物、包外區(qū)組分相關(guān)。

2.4 差異蛋白的代謝通路分析

差異蛋白的KEGG 分析發(fā)現(xiàn)：這些蛋白共涉及12 條代謝通路，主要包括代謝途徑、藥物代謝及胰島素抵抗等。糖尿病是一種全身代謝紊亂性疾病，一方面影響糖類代謝，導(dǎo)致高血糖，一方面影響脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的代謝。胰島素抵抗是導(dǎo)致糖尿病的重要因素，胰島素信號通路也和糖尿病息息相關(guān)。

3 討論

3.1 調(diào)節(jié)糖代謝

自20 世紀(jì)70年代以來，人們從海洋生物中分離出多種新型化合物，包括蛋白質(zhì)類、肽類、多糖類、生物堿類等等。生物活性肽治療效果好、副作用小，比蛋白質(zhì)穩(wěn)定，因此受到越來越多的關(guān)注[12]。生物活性肽不僅能為機體提供營養(yǎng)物質(zhì)，還具有多種功能，如抗氧化、抗輻射、抗衰老、降血糖、抗菌消炎、參與機體的免疫調(diào)節(jié)等[13]，還可以降低體內(nèi)血壓和血糖水平[14]。徐軍等[15]研究苦瓜多肽降血糖的功能。王茵等[16]研究從魚皮中提取膠原蛋白降壓肽。顧偉等[17]從大海馬蛋白中提取降壓肽。多肽調(diào)節(jié)血糖和血壓的作用主要表現(xiàn)在以下幾個方面，通過抗氧化、受體調(diào)節(jié)酶活性和糖代謝激素水平以及提高機體免疫力等增加糖的利用，抑制糖異生，以此來改善糖代謝和胰島素紊亂的癥狀。本文的研究結(jié)果顯示：仿刺參多肽能夠調(diào)節(jié)糖尿病小鼠胰島素信號通路中關(guān)鍵蛋白-視黃醇結(jié)合蛋白4 的表達(dá)，它一方面影響肝臟中肝糖的合成和輸出，調(diào)節(jié)機體的糖代謝，一方面調(diào)節(jié)胰島素信號通路中激酶活性和受體底物磷酸化，從而達(dá)到改善糖代謝和胰島素紊亂的癥狀。

圖2 試驗組（S）與模型組（M）差異蛋白GO 分析Fig.2 The GO cluster analysis of different expression proteins in S：M group

圖3 差異蛋白的KEGG 代謝通路分析Fig.3 The KEGG pathway analysis of the different expression proteins

圖4 試驗組差異蛋白參與的通路Fig.4 Differential protein pathway in experimental group

3.2 調(diào)節(jié)脂代謝

研究表明，糖尿病與血脂代謝紊亂密切相關(guān)，一般會導(dǎo)致血清TG、TC、LDL-C 升高同時HDL-C降低[18]，由此可引發(fā)高血壓、動脈粥樣化和冠心病等多種并發(fā)癥[19]。本論文中的糖尿病模型組小鼠的脂代謝紊亂現(xiàn)象，其TC、TG、LDL-C 含量均明顯高于正常對照組，HDL-C 水平顯著降低。而試驗組TG、LDL-C 水平均顯著降低，HDL-C 水平顯著升高，說明仿刺參多肽對糖尿病小鼠有調(diào)節(jié)血脂紊亂的作用。

3.3 調(diào)節(jié)胰島素信號通路

胰島素是調(diào)節(jié)能量代謝、 糖代謝和脂代謝的重要激素，當(dāng)體內(nèi)葡萄糖多余時，胰島素通過抑制肝臟葡萄糖生成，并且促進葡萄糖分解成非糖物質(zhì)，這種特異性反應(yīng)使得血糖水平降低、體內(nèi)葡萄糖水平保持在一個狹窄的范圍內(nèi)。這種穩(wěn)態(tài)的機制遭到破壞后就可能導(dǎo)致胰島素抵抗（IR）[20]。為了調(diào)節(jié)血糖的正常水平，機體分泌過多胰島素，從而導(dǎo)致機體一系列病理變化[21]。自2005年視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）被哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院發(fā)現(xiàn)以來，許多人就開始研究RBP4 在機體內(nèi)的作用機制，它是一種單一肽鏈的蛋白質(zhì)，屬于Lipocalin 超家族成員，相對分子質(zhì)量約為21 ku，包括181 個氨基酸殘基。人類RBP4 基因為單拷貝，大小約10 kb，位于與糖尿病發(fā)生有著密切聯(lián)系的染色體10 q23.3 上[22]。梁琳瑯等[23]發(fā)現(xiàn)代謝綜合征患者血清RBP4 的含量較高；Choi S[24]等研究發(fā)現(xiàn)妊娠期糖尿?。╬GDM）婦女產(chǎn)后糖耐量減低的嚴(yán)重程度與高RBP4 水平和低脂聯(lián)素水平有關(guān)。Frey S K 等[25]證實慢性腎臟疾病者血清RBP4 明顯高于正常對照者。近年來研究發(fā)現(xiàn)RBP4 是一種新型的、特殊的循環(huán)性脂肪因子，對于胰島素的合成與聚集具有重要作用[26]。它能夠抑制肌肉組織中胰島信號通路，并且能夠促進糖異生的進行，肝糖原輸出增加，導(dǎo)致胰島素抵抗，進而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生[27]。本文研究結(jié)果顯示，喂養(yǎng)仿刺參多肽的糖尿病體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)增加，視黃醇結(jié)合蛋白4的表達(dá)下調(diào)，磷脂酰肌醇3 激酶的活性和胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化恢復(fù)正常，血糖水平也恢復(fù)正常，胰島素通路正常，改善糖尿病的癥狀。

4 結(jié)論

仿刺參多肽可以降低糖尿病小鼠血清TC、TG、LDL-C 水平和胰島素濃度，提高HDL-C 水平，改善糖尿病小鼠血脂紊亂的現(xiàn)象。同時仿刺參多肽可以使糖尿病小鼠體內(nèi)視黃醇結(jié)合蛋白4 表達(dá)下調(diào)，使胰島素信號通路恢復(fù)正常，從而達(dá)到改善糖尿病的癥狀。