玉米肽和姜黃素對酒精性脂肪肝的作用

魏 穎 尹 曼 陳 亮 潘興昌 谷瑞增 蔡木易*

（1 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京100015 2 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心 北京100015）

脂肪肝（fatty liver disease，ALD）主要包括非酒精性脂肪肝 （non-alcoholic fatly liver disease，NAFLD）和酒精性脂肪肝 （alcoholic fatty liver disease，AFLD），涉及由簡單的脂肪變性到脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化的轉(zhuǎn)變。有研究表明，長期攝入酒精能夠通過提高血液中AST 酶活和氧自由基水平促進(jìn)脂肪肝的形成[1]。嚴(yán)重飲酒患者一般在飲酒1年后就會患有脂肪肝。肝臟是酒精代謝的主要器官，其在肝臟中的代謝主要依賴于NAD+的氧化還原酶系、 過氧化氫酶及細(xì)胞色素P450 酶系，產(chǎn)生大量的NADH，抑制脂肪酸的氧化并產(chǎn)生大量的ROS，引起脂肪在肝臟中的積累和肝臟的損傷。同時(shí)，酒精會增加活化的巨噬細(xì)胞對酒精的敏感度和腸黏膜滲透性，引起腸道細(xì)菌產(chǎn)物如LPS 釋放量的增加，引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)ROS 的產(chǎn)生[2-3]。

治療AFLD 最主要的是消除機(jī)體炎癥反應(yīng)和清除自由基[4]。天然植物成分中含有各種抗氧化物質(zhì)，且目前關(guān)于抗氧化物質(zhì)對AFLD 的干預(yù)作用已有許多研究報(bào)道。姜黃素是一種多酚類物質(zhì)，具有清除自由基和抗炎的作用，對小鼠急性酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，并提高急性酒精中毒小鼠的抗氧化力[5-6]。同時(shí)，玉米肽具有很好的保肝解酒功效，其支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）含量很高，而支鏈氨基酸具有上調(diào)過氧化物酶體相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生等功效，能夠緩解肝病患者病情的惡化[7-8]，更有相關(guān)試驗(yàn)來驗(yàn)證玉米肽保肝解酒的功效[9]。本試驗(yàn)采用OA 和乙醇聯(lián)合誘導(dǎo)HepG-2 細(xì)胞建立AFLD 模型，探討姜黃素和玉米肽復(fù)配對AFLD 的干預(yù)作用，為AFLD 營養(yǎng)食品的開發(fā)奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米肽，實(shí)驗(yàn)室制備；姜黃素，三生（中國）健康產(chǎn)業(yè)有限公司提供；MTT、OA，Sigma 公司；牛血清白蛋白（BSA），Amresco 公司；DMEM 培養(yǎng)基，Hyclone 公司；胎牛血清（FBS），四季青公司；胰蛋白酶、紅細(xì)胞裂解液、緩沖液PBS、青霉素鏈溶液、SOD 檢測試劑盒、LDH 檢測試劑盒、MDA 檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；ALT、AST、ADH 檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；TG 檢測試劑盒，浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司；DMSO，西隴化工股份有限公司；無水乙醇，北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra MR 多功能酶標(biāo)儀，美國Dynex 公司；ESCO AC2-6S1 生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司；HF90 二氧化碳培養(yǎng)箱，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；BD C6 流式細(xì)胞儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米肽和姜黃素對HepG-2 細(xì)胞增殖的影響 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，用DMEM完全培養(yǎng)基（含10% FBS 和1%青霉素鏈霉素溶液）調(diào)整細(xì)胞密度為105個/mL，接于96 孔板，每孔100 μL 細(xì)胞懸液。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞單層貼壁后更換DMEM 不完全培養(yǎng)基，加入玉米肽和姜黃素共同培養(yǎng)24 h，而后MTT 法檢測細(xì)胞增殖率。增殖率計(jì)算公式：

1.3.2 玉米肽和姜黃素對ALFD 模型細(xì)胞的干預(yù)作用 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，用DMEM 完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為105個/mL，接于12 孔板，每孔1 mL 細(xì)胞懸液。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞單層貼壁后更換不完全DMEM 培養(yǎng)基，加入OA（1 mmol/L）、玉米肽和姜黃素共同培養(yǎng)20 h，而后加入0.6%的無水乙醇繼續(xù)培養(yǎng)4 h，并設(shè)置空白對照組和相應(yīng)BSA 單獨(dú)添加組。分別檢測上清中ALT、AST、LDH 及胞內(nèi)TG、ADH、MDA、SOD 產(chǎn)生量，并用各孔的蛋白總量進(jìn)行校正，評價(jià)玉米肽和姜黃素復(fù)配對AFLD 的干預(yù)作用。

2 mmol/L OA 溶液的配制：31.61 μL OA 和1.675 g BSA 溶于50 mL DMEM 不完全培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH 為7.2～7.4，超聲至澄清液體狀態(tài)，過濾除菌，備用。同時(shí)制備不含OA 的相應(yīng)BSA 溶液。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）表示。采用組間t 檢驗(yàn)，P<0.05 具有顯著性差異，P<0.01 具有極顯著性差異。

表1 各試驗(yàn)組所添加玉米肽和姜黃素質(zhì)量濃度及共同作用濃度比例Table 1 The concentration and concentration ratio of corn peptide and curcumin used in the experiment

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 玉米肽和姜黃素對HepG-2 細(xì)胞增殖的影響

由 圖1可知，姜黃素在200 μg/mL 時(shí)對HepG2 細(xì)胞增殖率無顯著性影響，玉米肽在高質(zhì)量濃度2 000 μg/mL 時(shí)對HepG-2 細(xì)胞增殖仍無顯著性的抑制作用。說明試驗(yàn)所選各樣品濃度均不會影響HepG-2 細(xì)胞的正常生長。

圖1 玉米肽和姜黃素對HepG2 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of corn peptide and curcuminon proliferation of HepG2 cells

2.2 玉米肽和姜黃素對AFLD 模型細(xì)胞ALT 和AST 分泌量的影響

ALT、AST 是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)氨酶，是迄今為止國內(nèi)外應(yīng)用最為廣泛的反映肝細(xì)胞損害的指標(biāo)。ALT 只存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，1%的肝細(xì)胞被破壞，血清中的量就會增加一倍；AST 20%存在于肝細(xì)胞包漿內(nèi)，80%于線粒體中，在肝細(xì)胞輕度病變時(shí)，僅胞漿內(nèi)的AST 逸出；而當(dāng)病變嚴(yán)重時(shí)，線粒體中的AST 也會逸出[10]。而酒精肝在形成過程中，細(xì)胞受到炎癥反應(yīng)和ROS 的損傷，均會引起細(xì)胞外的ALT、AST 釋放量增加。

由圖2可知，較模型組，姜黃素和玉米肽單獨(dú)作用組及復(fù)配組均可顯著降低受損肝細(xì)胞ALT的分泌量（P<0.01），配方比例為1∶8（姜黃素∶玉米肽）時(shí)，抑制效果最好，分泌量僅為模型組的13.00%。由圖3可知，較模型組，姜黃素和玉米肽均可顯著降低受損肝細(xì)胞AST 的分泌量，配方比例為1 ∶8（姜黃素∶玉米肽）時(shí)，抑制效果最好，分泌量僅為模型組的37.51%。說明玉米肽和姜黃素復(fù)配對AFLD 具有干預(yù)作用，且均優(yōu)于玉米肽和姜黃素單獨(dú)作用組。

圖2 玉米肽和姜黃素對AFLD 模型細(xì)胞ALT 分泌的影響Fig.2 Effect of corn peptide and curcumin on secretion of ALT of AFLD model cells

2.3 玉米肽和姜黃素對AFLD 模型細(xì)胞LDH 釋放量的影響

LDH 屬于存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的大分子，正常情況下，LDH 是不能通過或少量釋出細(xì)胞膜，但在細(xì)胞膜受損傷、 通透性發(fā)生改變后，可通過受損細(xì)胞膜大量泄漏，通過檢測LDH泄漏量可在一定程度上反映細(xì)胞膜的損傷程度。如前所述，AFLD 在形成過程中，會造成肝臟細(xì)胞損傷，通過檢測LDH 泄漏量可以判斷姜玉米肽和姜黃素對肝細(xì)胞的保護(hù)作用。

由圖4可知，200 μg/mL 姜黃素及配方比例為1∶4 和1∶8（姜黃素∶玉米肽）均顯著降低細(xì)胞LDH泄漏量（P<0.05）。較模型組分別降低細(xì)胞LDH 泄漏量的15.02%，24.91%和29.85%。說明玉米肽和姜黃素復(fù)配能夠保護(hù)受損肝細(xì)胞，且均優(yōu)于玉米肽和姜黃素單獨(dú)作用組。

2.4 玉米肽和姜黃素對AFLD 模型細(xì)胞內(nèi)TG累積的影響

TG 是人體內(nèi)含量最多的脂類，肝臟可合成TG，但若TG 在肝臟中積累則會造成脂肪肝。AFLD 在形成過程中會產(chǎn)生大量的NADH，抑制脂肪酸的氧化，造成脂肪在肝臟中的積累，進(jìn)一步惡化脂肪肝[2]。

圖3 姜黃素和玉米肽對AFLD 模型細(xì)胞AST 分泌的影響Fig.3 Effect of curcumin and corn peptide on secretion of AST of AFLD model cells

由圖5可知，200 μg/mL 姜黃素以及配方比例為1 ∶4 和1 ∶8（姜黃素∶玉米肽）均可顯著降低受損肝細(xì)胞內(nèi)TG 的累積（P<0.05），較模型組而言分別降低了細(xì)胞內(nèi)TG 含量的20.53%，14.43%和21.24%。說明玉米肽和姜黃素復(fù)配具有抑制脂肪累積的作用，緩解AFLD，且配方比例為1∶8 的作用效果最好，優(yōu)于玉米肽和姜黃素單獨(dú)作用組。

2.5 玉米肽和姜黃素對AFLD 模型細(xì)胞MDA 產(chǎn)生量的影響

AFLD 在形成過程中會產(chǎn)生大量的ROS，造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，對細(xì)胞產(chǎn)生損傷[11]。MDA 是生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的毒性終產(chǎn)物，會破壞DNA和蛋白質(zhì)的合成以及干擾電子傳遞鏈的進(jìn)行，進(jìn)一步對細(xì)胞活性產(chǎn)生影響[12]。通過檢測MDA 的產(chǎn)生量可以反映細(xì)胞內(nèi)ROS 水平和細(xì)胞的受損狀況。

由圖6可知，姜黃素和玉米肽單獨(dú)作用組及復(fù)配組均可顯著降低受損肝細(xì)胞內(nèi)MDA 的產(chǎn)生（P<0.05），且復(fù)配組要優(yōu)于玉米肽單獨(dú)作用組，說明玉米肽和姜黃素復(fù)配能夠增強(qiáng)玉米肽的護(hù)肝功效。

2.6 玉米肽和姜黃素對AFLD 模型細(xì)胞SOD 活性的影響

SOD 是金屬螯合酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。對于乙醇引起的機(jī)體肝中毒和過氧化，機(jī)體會過量表達(dá)SOD 來起到保護(hù)作用，而AFLD 會導(dǎo)致SOD 活性的顯著下降，進(jìn)一步導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化及肝損傷，可能是由于乙醇會導(dǎo)致其降解或干擾其轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控[13-14]。通過檢測添加樣品前后AFLD 模型細(xì)胞SOD 的活性，可以很好地判斷姜黃素和玉米肽復(fù)配對AFLD 模型細(xì)胞的自身抗氧化的影響。

圖4 玉米肽和姜黃素對AFLD 模型細(xì)胞LDH 泄漏的影響Fig.4 Effect of corn peptide and curcumin on leakage of LDH of AFLD model cells

由圖7可知，各試驗(yàn)組相比模型組均可顯著促進(jìn)受損肝細(xì)胞內(nèi)SOD 的活力（P<0.01），其中配方比例為1 ∶4 和1 ∶8（姜黃素∶玉米肽）時(shí)的SOD活力分別是模型組的8.92 倍和8.06 倍。說明玉米肽和姜黃素復(fù)配能夠增強(qiáng)AFLD 模型細(xì)胞的抗氧化力，緩解肝細(xì)胞的受損狀況，且均優(yōu)于玉米肽和姜黃素單獨(dú)作用組。

圖5 玉米肽和姜黃素對AFLD 模型細(xì)胞內(nèi)TG 累積的影響Fig.5 Effect of corn peptide and curcumin on accumulation of TG of AFLD model cells

圖6 玉米肽和姜黃素對AFLD 模型細(xì)胞MDA 形成的影響Fig.6 Effect of corn peptide and curcumin on formation of MDA of AFLD model cells

圖7 玉米肽和姜黃素對AFLD 模型細(xì)胞SOD 活力的影響Fig.7 Effect of curcumin and corn peptide on catalysis activity of SOD of AFLD model cells

2.7 玉米肽和姜黃素對AFLD 模型細(xì)胞ADH 活力的影響

ADH 是酒精代謝的重要酶系，可轉(zhuǎn)化乙醇為乙醛，再在乙醛脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為乙酸，通過三羧酸循環(huán)代謝為水和CO2。ADH 能夠代謝肝臟中80%的乙醇，具有重要的解酒活性[15]。有研究表明，灌胃小鼠ADH/NAD+等量混合液10 min 后再灌胃小鼠56°白酒，1 h 后ADH 表現(xiàn)出顯著的解酒功效[16]。同時(shí)，乙醇在肝細(xì)胞可作為羥乙基自由基造成脂質(zhì)的過氧化[15]，對肝細(xì)胞造成損傷。通過檢測ADH 活力，可以反應(yīng)肝細(xì)胞的解酒能力，也進(jìn)一步評價(jià)姜黃素和玉米肽復(fù)配組對AFLD 模型細(xì)胞的保護(hù)作用。

由圖8可知，200 μg/mL 姜黃素、 配方比例為1∶4 和1∶8（姜黃素∶玉米肽）均可顯著提高受損肝細(xì)胞內(nèi)ADH 的活力（P<0.01），ADH 活力分別是模型組的2.28 倍、1.77 倍和1.67 倍。說明玉米肽和姜黃素復(fù)配能夠增強(qiáng)玉米肽的解酒功效。

圖8 玉米肽和姜黃素對AFLD 模型細(xì)胞ADH 活力的影響Fig.8 Effect of curcumin and corn peptide on catalysis activity of ADH of AFLD model cells

3 結(jié)論

FLD 的發(fā)生涉及多方面因素，如氧化應(yīng)激、代謝異常、炎癥反應(yīng)等，但AFLD 中乙醇引起的氧化應(yīng)激損傷早在上世紀(jì)60年代就有人開始研究。關(guān)于AFLD 的治療最主要的是戒酒，但目前關(guān)于AFLD 患者的營養(yǎng)干預(yù)治療也越來越受到關(guān)注。AFLD 患者由于體內(nèi)能量代謝失衡，常伴有營養(yǎng)失調(diào)的發(fā)生，對患者補(bǔ)充足夠的營養(yǎng)物質(zhì)尤為重要，其應(yīng)保證每天1.2～1.5 g/kg 蛋白質(zhì)的補(bǔ)充和35～40 kcal/kg 卡路里的攝入[4]。支鏈氨基酸對FALD具有很好的緩解作用，有研究表明亮氨酸對乙醇的代謝具有協(xié)同作用[9]。同時(shí)，增加維生素、姜黃素、益生菌、鋅、植物抗氧化物質(zhì)多酚、黃酮及優(yōu)質(zhì)蛋白等的攝入，均可從抗氧化和抗炎方面對緩解AFLD 方面產(chǎn)生一定功效[17]。本試驗(yàn)通過體外構(gòu)建了AFLD 細(xì)胞模型，評價(jià)玉米肽和姜黃素復(fù)配對AFLD 的干預(yù)作用。以上結(jié)果表明，玉米肽和姜黃素復(fù)配能夠顯著降低模型細(xì)胞AST 和ALT 的分泌量，降低LDH 的泄漏量、減少M(fèi)DA 的產(chǎn)生，提高SOD 和ADH 的活力，且均優(yōu)于玉米肽單獨(dú)作用組，說明玉米肽和姜黃素復(fù)配能增強(qiáng)玉米肽保肝解酒的功效，且從總體來說，也優(yōu)于姜黃素單獨(dú)作用組，可作為AFLD 患者的營養(yǎng)食品。