RpoE 缺陷對甲型副傷寒沙門氏菌在肉制品加工中熱失活特性的影響

王亞飛 李苗云 崔文明 趙改名 柳艷霞 高曉平

（1 河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院 河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點實驗室 鄭州450002 2 中檢集團中原農(nóng)食產(chǎn)品檢測（河南）有限公司 鄭州450002）

甲型副傷寒沙門氏菌是一種無莢膜的革蘭氏陰性桿菌，能夠引起傷寒癥。據(jù)統(tǒng)計，傷寒癥導致每年217 000 人死亡，其中中南亞和東南亞是主要的疾病暴發(fā)地。已報道的幾乎80%傷寒病例來自于8 個南亞國家（孟加拉國、中國、印度、印度尼西亞、老撾、尼泊爾、巴基斯坦和越南），發(fā)病以兒童，青少年較多[1]。目前，傷寒腸熱病仍是全球的重大公共衛(wèi)生問題之一，尤其是在亞洲。食品中殺菌的方法很多，包括物理、化學和生物等。熱處理是商業(yè)應用的標準方法，它是食品工業(yè)最經(jīng)濟、最簡便和使用最廣泛的殺菌方法。為了減少高溫對肉制品的風味、營養(yǎng)成分的破壞，許多肉制品加工都采用巴氏殺菌的方法來減少細菌病原體[2-3]。然而，肉類產(chǎn)品的物理和化學特性都可以影響熱加工對微生物的殺傷力，因此研究甲型副傷寒沙門氏菌在肉制品加工過程中熱響應特性機理是必要的。

σ 因子是原核生物生命活動中的重要調(diào)節(jié)因子，尤其在響應各種不同環(huán)境應激時發(fā)揮重要作用[4]。RpoE 調(diào)節(jié)因子是由rpoE 基因編碼，是腸桿菌科中重要的σ 因子[5]。目前rpoE 基因功能研究主要集中于大腸桿菌，功能集中以下方面：溫度脅迫、營養(yǎng)脅迫、高滲脅迫、氧化脅迫、其它脅迫和致病過程。而對rpoE 在鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌的作用也有初步研究，rpoE 對甲型副傷寒沙門氏菌在肉制品加工過程的復雜的環(huán)境條件下的作用尚不清楚。

要確定rpoE 基因功能，需使該基因在甲型副傷寒沙門氏菌中缺失，然后比較缺陷株和野生株的差異，來確定其在肉制品加工過程的復雜環(huán)境下的功能。本研究用缺陷株是前期試驗中利用Red 同源重組技術對甲型副傷寒沙門氏菌rpoE基因敲除獲得的。

為研究甲型副傷寒沙門氏菌rpoE 作為σ 因子在肉制品加工過程的復雜外界環(huán)境下的作用，首先通過PCR 檢驗△rpoE 缺陷株缺陷并穩(wěn)定表達，然后比較缺陷株和野生株在肉制品加工條件下的致死情況，并在接近加工的不同溫度下重復試驗，明確rpoE 對甲型副傷寒的影響，進一步研究甲型副傷寒沙門氏菌在不同環(huán)境下的應激反應。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 試驗所用甲型副傷寒沙門氏菌是從肉中分離的經(jīng)過國標法生化鑒定、Vitek 測定以及測序鑒定的。缺陷株△rpoE 是前期試驗利用此株甲型副傷寒通過Red 同源重組構建的。

1.1.2 試劑 營養(yǎng)肉湯 （Nutrient Broth，NB），青島高科園海博生物技術有限公司；木糖賴氨酸脫氧 膽 鹽 （Xylose Lysine deoxycholate Salt Agar，XLD）瓊脂，青島高科園海博生物技術有限公司；氯化鈉（分析純），天津市瑞金特化學有限公司；Ezup 柱式基因組DNA 抽提試劑盒（細菌），上海生物工程有限公司；引物由上海生物工程有限公司合成。

1.1.3 儀器與設備 HVE-50 高壓蒸汽滅菌鍋，日本HIRAYAMA 公司；SPX-1505H-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械公司；SW-CJ-2F 超級工作臺，蘇州安泰空氣計數(shù)有限公司；THZ-C 臺式恒溫振蕩器，太倉市華美生化儀器廠；EasyMix 均質(zhì)機，法國AES 公司；THZ-82 水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 缺陷株△rpoE 鑒定 試驗所用甲型副傷寒沙門氏菌是從肉中分離的經(jīng)過國標法生化鑒定、Vitek 測定以及測序鑒定的。缺陷株△rpoE 是前期試驗利用此株甲型副傷寒通過Red 同源重組構建的。將野生株和缺陷株從冰箱里取出，復蘇，分別接種于營養(yǎng)肉湯（NB）中，置于37 ℃過夜培養(yǎng)，檢查生長情況。采用Ezup 柱式基因組DNA 抽提試劑盒（細菌）提取野生株和缺陷株的基因組DNA。根據(jù)NCBI 沙門氏菌rpoE 基因序列用Primer Premier 5.0 軟 件 設 計 引 物 F：GAATCGCGGATCAGGT，R：TGCGGCTTATGGAGTG，缺陷株和野生株在繁殖10 代后進行PCR 鑒定，所擴增片段大小分別為1 261，795 bp，對比野生株和缺陷株PCR 產(chǎn)物，確定缺陷株穩(wěn)定性。

1.2.2 野生株和缺陷株在最適溫度37 ℃條件下的生長能力 分別挑取野生株和缺陷株單菌落，接種于NB 液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)。然后按1∶100 比例接入新鮮NB 液體培養(yǎng)基中，調(diào)整OD600值相等后37 ℃培養(yǎng)，每隔2 h 采用涂布法測定菌落數(shù)，考察野生株和缺陷株的生長能力。

1.2.3 甲型副傷寒沙門氏菌野生株和缺陷株在介質(zhì)中的熱處理 挑取野生株和缺陷株甲型副傷寒沙門氏菌單菌落，分別接種于100 mL NB 液體培養(yǎng)基中37 ℃搖床培養(yǎng)16 h，達到穩(wěn)定期。用純瘦肉灌腸作為介質(zhì)，采用注射法進行人工污染，人工污染的菌液濃度為108CFU/mL，樣品攪碎稱取25 g 注射2.5 mL 菌液[6]，放入真空袋中壓成片狀，用真空包裝機抽真空，并封口，37 ℃培養(yǎng)16 h。水浴鍋溫度設為55，63，72 ℃，加熱時間從0～180 min不等。加熱時，將樣品完全浸沒熱水中，按照預先設定的時間間隔，定時取出樣品進行測定。熱處理后的樣品應立即放入預先準備好的冰水中阻止其繼續(xù)進行熱失活過程。從設定的溫度冷卻至室溫的時間小于10 s。

1.2.4 活菌計數(shù) 采用稀釋涂布XLD 培養(yǎng)基進行活菌計數(shù)，37 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，采用SPSS17.0 進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均為3 個平行樣品測定3 次。D 值是指在某溫度下，活菌數(shù)死亡90%所需要的時間，即細菌殘存曲線經(jīng)一個對數(shù)周期所需的時間。D 值是細菌死亡率的倒數(shù)，D 值越大死亡速度越慢，該菌的耐熱性越強。用Linear 模型擬合熱致死曲線式中，x 表示加熱時間，y 表示細菌活細胞的對數(shù)值，可得出該函數(shù)的斜率的負倒數(shù)為所求的D 值，即D=-1/k。

2 結果與分析

2.1 缺陷株PCR 鑒定

繁殖10 代后，提取缺陷株和野生株的DNA，然后進行PCR 擴增，可看出野生株可以擴增出大小約795 bp 基因片段，而突變株擴增出1 261 bp的基因片段（red 重組敲除工作中未進行抗性基因無痕敲除，因此缺陷株的片段比野生株長），不過從結果看出缺陷株無法正常表達rpoE （圖1），證實了缺陷株△rpoE 的基因穩(wěn)定性。

通過對最適溫度37 ℃下缺陷株和野生株24 h 的生長情況的測定，繪制生長曲線，通過菌液濃度差異來比較兩株菌生長情況（圖2）。經(jīng)統(tǒng)計學分析可得，37 ℃時，Mann-Whitney U test 非參數(shù)檢驗得P＞0.05，野生株和缺陷株的生長數(shù)據(jù)沒有顯著性差異，可以得出兩者生長的情況幾乎沒有差別，說明在非應激條件下，rpoE 基因的活性可能被抑制而不發(fā)揮作用。

圖1 繁殖10 代后野生株和缺陷株凝膠電泳鑒定Fig.1 Verification of the wild and mutant strain after 10 generations of reproduction

圖2 野生株和缺陷株37 ℃生長曲線Fig.2 The growth curve of wild strains and mutant strains at 37 ℃

2.2 甲型副傷寒沙門氏菌野生株和缺陷株在不同溫度下的熱失活效果

通過模擬肉制品加工過程中近似巴氏殺菌的條件，本試驗選擇了55，63，72 ℃3 個溫度進行對純瘦肉灌腸進行熱處理。研究結果如圖3所示，甲型副傷寒沙門氏菌缺陷株和野生株的熱失活情況有所不同，缺陷株的耐熱能力弱于野生株，并且隨著樣品進行熱處理的時間越長，缺陷株的耐熱能力越弱于野生株，直至全部死亡。

圖3 野生株和缺陷株的熱失活曲線Fig.3 The survival curves of wild strains and mutant strains

2.3 甲型副傷寒沙門氏菌野生株和缺陷株在不同溫度下的耐熱性分析

殘存菌落數(shù)的對數(shù)值隨著加熱時間的延長而降低。如表1所示，利用Linear 方程求得的甲型副傷寒沙門氏菌野生株和缺陷株的熱失活模型的判定系數(shù)R2都大于0.9，并且野生株和缺陷株在55℃的D 值分別為14.0980，10.8933 min，在63 ℃的D 值分別為1.3078，0.3147 min，在72 ℃的D 值分別為0.9885，0.9135 min。3 個溫度下甲型副傷寒沙門氏菌缺陷株和野生株的D 值之間有顯著性差異（t<0.05）。隨著溫度的升高，缺陷株和野生株的D 值都隨之降低，并且3 個溫度下，甲型副傷寒沙門氏菌缺陷株的D 值都明顯低于野生株，缺陷株相對于野生株對高溫更加敏感，證明rpoE 對甲型副傷寒沙門氏菌在高溫下耐熱性發(fā)揮特定作用，rpoE 缺失會導致甲型副傷寒沙門氏菌對高溫的抵抗能力明顯下降。

表1 甲型副傷寒沙門氏菌缺陷株和野生株熱處理D 值Table 1 D-values of Salmonella paratyphi A mutant strains and wild strains

3 討論

本研究采用的敲除方法是Baudin 等[7]提出的一種后人稱為短側(cè)翼同源區(qū)PCR 介導基因敲除的方法，是一種近年興起的體內(nèi)同源重組的新型遺傳工程技術[8-11]。該技術僅需要35～60 bp 的同源序列就可以完成對目的基因的精確敲除，并且重組效率極高[12]。試驗發(fā)現(xiàn)，此方法也適用于甲型副傷寒沙門氏菌基因的敲除，并且其穩(wěn)定性極好。

有研究表明，rpoE 對大腸桿菌的生存是必不可少的[13]，如大腸桿菌rpoE 的缺失會導致菌株立即死亡[14]。然而對于其他細菌，如鼠傷寒沙門氏菌等和具有和大腸桿菌同源性較高的細菌的生存的影響并不顯著。本研究結果顯示，從△rpoE 的傳代穩(wěn)定性和最適溫度下的生長情況，可以看出rpoE的缺失并不影響甲型副傷寒沙門氏菌的生存能力，并且在最適溫度下，rpoE 基因的活性可能在沒有受到外界環(huán)境的脅迫下并不會發(fā)揮作用。

比較不同溫度下缺陷株和野生株致死情況，證明rpoE 基因?qū)仔透眰抽T氏菌的耐熱能力具有重要作用。進一步闡明了rpoE 基因作為σ因子在甲型副傷寒沙門氏菌響應環(huán)境脅迫過程中的生物學功能，為進一步探討甲型副傷寒沙門氏菌耐熱機理及其相關分子調(diào)控機制提供了新的依據(jù)和有意義的嘗試。