魷魚墨黑色素的提取及其對A549細(xì)胞的影響

江 凱 劉 亮 曹少謙 陳秋平 戚向陽

（1 浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校食品學(xué)院 浙江寧波315100 2 浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 浙江寧波315100）

魷魚（Todarodes pacificus）屬軟體動物門，頭足綱，二鰓亞綱，十腕目，槍烏賊科動物，也稱槍烏賊、柔魚。近年來，魷魚捕撈已成為我國海洋漁業(yè)的重要組成部分，2014年我國魷魚捕撈量達(dá)37.4727 萬t[1]。魷魚加工是我國水產(chǎn)加工業(yè)的主要組成部分，魷魚可食部分約占總體重的80%。其加工過程中魷魚皮、魷魚墨囊、肝臟等副產(chǎn)物往往被廢棄或加工成低值飼料，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。魷魚墨囊約占總體重的1.3%，主要化學(xué)成分是黑色素和蛋白多糖復(fù)合體[2-3]。雖然有關(guān)于魷魚墨的研究及應(yīng)用近十年才有報道，但烏賊墨的應(yīng)用歷史卻甚為悠久，早在唐代陳藏器的《本草拾遺》中便對烏賊墨有味澀，入心經(jīng)，活血化瘀，涼血止血的描述[4]。魷魚墨成分和烏賊墨十分相似[5]。近年來，魷魚墨抗腫瘤、抗?jié)?、提高免疫力等活性也逐漸被報道[6-9]。另外，魷魚在遠(yuǎn)洋深海生活，本身受到的污染較少，因此魷魚墨極具開發(fā)潛力。目前魷魚墨的綜合利用成為廢棄物高值化利用的研究熱點(diǎn)。

黑色素是生物體中廣泛存在的保護(hù)性色素。隨著黑色食品如黑芝麻、烏骨雞、黑木耳等食物潛在的抗氧化、抗衰老等功效的報道，黑色素引起人們濃厚的興趣，天然黑色素的研究和應(yīng)用日益增多[10-12]。相比其它動植物組織中黑色素的研究，魷魚墨黑色素的研究相對較少，且主要集中在結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上，而對其生物活性的研究鮮見報道。魷魚墨多肽能抑制DU-145、PC-3 細(xì)胞增殖[13]，而魷魚黑色素對腫瘤細(xì)胞的作用未見報道，僅有少量其免疫活性、 自由基清除活性等方面的報道[14-18]。其提取分離方法不同會導(dǎo)致活性差異，目前黑色素的提取、 分離方法主要有水洗法、 酶解法、酸水解法、堿水解法及超聲法[19]。本文采用酸堿法提取黑色素提取物（SIME），在此基礎(chǔ)上，以人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 為對象，通過研究細(xì)胞增殖及細(xì)胞遷移能力等方面探討SIME 對A549 細(xì)胞的影響，以期為魷魚墨高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

北太平洋魷魚墨囊由中國水產(chǎn)舟山海洋漁業(yè)公司提供，在-18 ℃凍藏。使用時4 ℃下解凍，擠壓丟棄表皮膜與內(nèi)部的網(wǎng)狀膜即得魷魚墨。

試驗(yàn)所用試劑氫氧化鈉、 鹽酸、 二甲基亞砜（DMSO）等均為國產(chǎn)分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT），購于美國Sigma公司。RPMI-1640 培養(yǎng)基，美國HyClone 公司；胎牛血清（FBS），美國Gibco 公司；吖啶橙，北京Solarbio 公司；胰蛋白酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司；A549 細(xì)胞，購于中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

試驗(yàn)所用主要設(shè)備與儀器：5804R 高速離心機(jī)，德國Eppendorf；5430R 小型高速離心機(jī)，德國Eppendorf；MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱，日本SANYO；熒光倒置顯微鏡，日本Nikon；Infinite 200 PRO 多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan；UV-1700 紫外-可見分光光度計，日本島津。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 魷魚墨黑色素的提取 稱取一定量魷魚墨，按不同料液比加入不同濃度NaOH 溶液，在一定溫度下提取一定時間后，離心（10 000 r/min，10 min），沉淀繼續(xù)按上述操作提取2 次。合并上清液，用濃鹽酸調(diào)pH 至2.0，靜置12 h 后離心（10 000 r/min，10 min）取沉淀，沉淀水洗3 次后冷凍干燥即得魷魚墨黑色素提取物。SIME 得率（mg/g）=SIME 質(zhì)量/原料質(zhì)量。

1.2.1.1 浸提溫度對SIME 提取的影響 料液比1∶40，提取時間1 h，NaOH 溶液濃度1 mol/L，提取溫度分別為60，70，80，90，100 ℃進(jìn)行提取。每組試驗(yàn)設(shè)3 個平行組，取平均值。

1.2.1.2 浸提時間對SIME 提取的影響 料液比1∶40，提取溫度100 ℃，NaOH 溶液濃度1 mol/L，提取時間分別為0.5，1，1.5，2，2.5 h 進(jìn)行提取。每組試驗(yàn)設(shè)3 個平行組，取平均值。

1.2.1.3 料液比對SIME 提取的影響 提取溫度100 ℃，提取時間1 h，NaOH 溶液濃度1 mol/L，料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 進(jìn)行提取。每組試驗(yàn)設(shè)3 個平行組，取平均值。

1.2.1.4 堿液濃度對SIME 提取的影響 料液比1∶40，提取溫度100 ℃，提取時間1 h，NaOH 溶液濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mol/L 進(jìn)行提取。每組試驗(yàn)設(shè)3 個平行組，取平均值。

1.2.1.5 SIME 提取條件的確定 根據(jù)料液比、浸提溫度、 浸提時間、 堿液濃度對SIME 提取的影響，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 無菌條件下，把A549 細(xì)胞接種到裝有適量RPMI-1640 培養(yǎng)液（含10%FBS）的培養(yǎng)瓶，并放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液。待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%～90%時，用適量0.25%胰酶消化，取1∶4 比例進(jìn)行傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 吖啶橙熒光染色觀察SIME 對A549 細(xì)胞的作用 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)消化分散制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，以每孔4×104個的細(xì)胞密度接種于12 孔板，每孔加入細(xì)胞懸液2 mL，然后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，分別加入質(zhì)量濃度為0，0.5，1 mg/mL 的SIME 樣液0.5 mL。繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，吸棄上清液，用PBS（pH 7.4）清洗3 次。常溫避光，每孔加入0.5 mL 吖啶橙溶液（0.1 mg/mL）進(jìn)行染色，然后在熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4 SIME 對A549 細(xì)胞增殖率的影響 采用MTT 法[20]。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)消化分散制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，以每孔3×103個的細(xì)胞密度接種于96 孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 L，然后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，分別加入濃度梯度為0，0.125，0.25，0.5，0.75，1 mg/mL 的SIP 樣液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 及72 h 后，每孔加入20 L MTT 溶液（5 mg/mL），4 h 后3 000 r/min 離心10 min，吸棄孔中上清液，每孔加入100 L DMSO，振蕩均勻。490 nm 波長下，置酶標(biāo)儀上測定各孔吸光值。細(xì)胞增殖抑制率=（1-OD樣品/OD空白）×100%

1.2.5 SIME 對A549 細(xì)胞遷移能力的影響 采用石惠等[21]的方法。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)消化分散制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，以每孔1.5×105個的細(xì)胞密度接種于24 孔板，待細(xì)胞長滿時，用20 L 的小槍頭在每孔中劃一條直線，吸棄孔中培養(yǎng)液后用PBS 清洗3 次，更換新鮮培養(yǎng)液，并分別加入不同劑量的SIME，培養(yǎng)24 h 后拍照。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 進(jìn)行統(tǒng)計分析，并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 魷魚墨黑色素的提取

由圖1可知，提取溫度對SIME 的提取有較大的影響，得率隨浸提溫度升高而增加，這可能是由于黑色素本身的物化性質(zhì)，在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)隨著提取溫度的增強(qiáng)其在堿液中的溶解能力也隨之越強(qiáng)。圖2表明，SIME 得率隨浸提時間的延長而增加，1.5 h 后得率增加緩慢，長時間浸提延長樣品提取周期，且處理時間過長還可能會對黑色素造成破壞，因此浸提時間選擇1.5 h 以內(nèi)較為合適。由圖3可知，SIME 得率隨料液比增加而增加，料液比1∶40 之后，得率略有下降，這可能是由于隨著料液比的增加，黑色素的浸出總量并沒有明顯增加，導(dǎo)致提取液中的黑色素濃度下降，致使黑色素在酸沉過程中沉降不完全，從而導(dǎo)致得率略有降低，同時，料液比的增加會大大增加試驗(yàn)工作量，因此，料液比的選擇以不超過1∶40 較為合適。由圖4可知，當(dāng)堿濃度小于1.0 mol/L 時，SIME 得率隨堿濃度增加而增加，但堿濃度過高時，SIME得率隨堿濃度增加而急劇下降，這可能是由于黑色素與蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)以結(jié)合形式存在，堿濃度過高對蛋白質(zhì)及脂類物質(zhì)造成較大影響，從而影響黑色素的提取，同時，堿濃度增加可能會導(dǎo)致堿溶性雜質(zhì)的增加，且在進(jìn)行酸沉?xí)r會導(dǎo)致酸的用量加大，從而影響黑色素酸沉的效率，故堿濃度為1.0 mol/L 較合適。

圖1 提取溫度對SIME 得率的影響Fig.1 Effects of temperature on extraction of SIME

圖2 提取時間對SIME 得率的影響Fig.2 Effects of time on extraction of SIME

圖3 料液比對SIME 得率的影響Fig.3 Effects of material-liquid ratio on extraction of SIME

圖4 堿液濃度對SIME 得率的影響Fig.4 Effects of alkali concentration on extraction of SIME

根據(jù)各因素對SIME 得率的影響，設(shè)計L9（34）正交試驗(yàn)（表1）。根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果（表2）可知，影響SIME 提取效果的因素依次為：堿濃度＞提取時間＞提取溫度＞料液比；SIME 提取的最佳條件為A3B3C1D2，即提取溫度100 ℃，提取時間1.5 h，料液比1∶30，堿液濃度1.0 mol/L，在此條件下SIME 得率為20.13%。

2.2 吖啶橙熒光染色觀察SIME 對A549 細(xì)胞的作用

SIME 作用A549 細(xì)胞72 h 后，經(jīng)吖啶橙染色，熒光倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組細(xì)胞數(shù)量較多，狀態(tài)良好，細(xì)胞呈長梭形或多角形，胞質(zhì)飽滿，相鄰細(xì)胞生長融合成片。加入SIME 后，細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)都發(fā)生了變化，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時，A549 細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞質(zhì)部分收縮，出現(xiàn)明顯樹突結(jié)構(gòu)；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL 時，細(xì)胞數(shù)量驟減，細(xì)胞質(zhì)收縮，出現(xiàn)固縮的圓形結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，SIME 對A549 細(xì)胞生長具有抑制作用，且伴隨一定濃度效應(yīng)。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)置表Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 The results of L9（34）orthogonal test

圖5 SIME 對A549 細(xì)胞的影響Fig.5 Effects of SIME on A549 cells

2.3 SIME 對A549 細(xì)胞增殖率的影響

由圖6可知，SIME 可抑制A549 細(xì)胞生長，且呈一定量效和時效關(guān)系，作用相同時間下，SIME對A549 細(xì)胞的生長抑制效果隨SIME 濃度增加而增強(qiáng)，SIME 濃度相同時，隨著所用時間的延長，SIME 對A549 細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)。作用48 h后，SIME 質(zhì)量濃度0.5 mg/mL 時，其對A549 細(xì)胞的增殖抑制率為27.81%，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，抑制率達(dá)79.94%。作用72 h 后，SIME 質(zhì)量濃度0.25 mg/mL 時，對細(xì)胞的增殖抑制率為42.93%，遠(yuǎn)高于48 h 時的18.17%。

2.4 SIME 對A549 細(xì)胞遷移能力的影響

通過劃痕試驗(yàn)觀察SIME 對A549 細(xì)胞非定向遷移的影響，結(jié)果如圖7所示?？瞻捉M細(xì)胞經(jīng)24 h 生長后，細(xì)胞遷移距離較大，劃痕寬度明顯變窄，而SIME 作用下，經(jīng)24 h 生長后，細(xì)胞遷移距離遠(yuǎn)小于空白組細(xì)胞，劃痕僅略微變窄。結(jié)果表明，SIME 具有抑制細(xì)胞非定向遷移的作用。

圖6 SIME 對A549 細(xì)胞增殖率的影響Fig.6 Effects of SIME on proliferation rate of A549 cells

圖7 SIME 對A549 細(xì)胞遷移能力的影響Fig.7 Effects of SIME on A549 cells migration

3 討論

黑色素廣泛存在于動植物體內(nèi)，其基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)是一些共價交聯(lián)的吲哚環(huán)，根據(jù)產(chǎn)生前體不同可分為：真黑色素、棕黑色素和神經(jīng)元黑色素三類。魷魚墨黑色素屬于典型的真黑色素，雖然目前已有一些研究涉及其提取制備[22-26]，但不同的提取分離方法對黑色素得率、 純度及生物活性均有較大的影響。高速離心法操作簡單，不影響其生物活性，但只能去除墨汁中水溶性雜質(zhì)，且所得黑色素純度不高；酸、堿水解法制備所得黑色素雖然純度較高，但過程中酸堿作用下劇烈水解，會破壞黑色素結(jié)構(gòu)完整性，研究表明，強(qiáng)酸水解會導(dǎo)致黑色素脫羧基，且容易使蛋白轉(zhuǎn)變成類色素物，而強(qiáng)堿處理會導(dǎo)致黑色素與蛋白質(zhì)發(fā)生作用；而酶解法處理相對溫和，不會破壞黑色素結(jié)構(gòu)，但無法去除不被酶解的雜質(zhì)，且成本較高，條件苛刻。劉顯威等[26]利用黑色素堿溶酸沉的特性來提取魷魚墨黑色素，此方法所得黑色素純度較高，且結(jié)構(gòu)和表面形態(tài)未受破壞，得率為16.69%。本試驗(yàn)亦利用此特性制備SIME，提取條件有別于前人的研究，最優(yōu)條件下SIME 得率為20.13%，略高于劉顯威等人報道。這不僅與提取工藝有關(guān)，還可能受魷魚品種、原料含水量等因素影響。不僅提取方法可能會影響黑色素的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致活性差異，干燥方法同樣會影響黑色素的聚集方式，也可能會影響黑色素的溶解性及生物活性。目前制備黑色素的干燥方法主要有真空冷凍干燥、減壓干燥、噴霧干燥等，本試驗(yàn)采用真空冷凍干燥法。本試驗(yàn)未對SIME進(jìn)一步精制即進(jìn)行活性研究，而純度也可能會影響其活性，因此后期需對SIME 提取物進(jìn)一步精制，以便于更全面地研究黑色素活性及其作用機(jī)制。

關(guān)于SIME 生物活性的研究報道較少，陳士國等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)SIME 具有較高的清除自由基能力，能顯著提高機(jī)體免疫功能，甄天元、雷敏等[16-18]也證實(shí)了SIME 能有效改善免疫低下模型小鼠的免疫調(diào)節(jié)機(jī)能，具有增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、延緩衰老的功效。本試驗(yàn)以A549 為研究對象，探討SIME 對肺癌細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，SIME 對A549 的增殖具有較好的抑制作用，且伴隨一定劑量與時間效應(yīng)。SIME 作用細(xì)胞48 h 時，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.747 mg/mL，作用72 h 時，IC50為0.396 mg/mL，隨著SIME 作用時間的延長，SIME對細(xì)胞的抑制效果增加明顯。呂留莊等[27]研究表明藍(lán)莓總花青素作用對A549 細(xì)胞活力有明顯抑制作用，作用72 h 后，IC50值為176.652 g/mL，其作用效果優(yōu)于SIME；戴關(guān)海等[28]報道3.13 mg/mL 楊梅醇作用A549 細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞存活率約50%，其對A549 細(xì)胞的抑制作用也遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于SIME。雖然SIME 對腫瘤細(xì)胞的作用未見報道，但魷魚墨多肽對腫瘤細(xì)胞的作用曾被研究，李麗等[13]試驗(yàn)表明魷魚墨多肽能抑制DU-145 和PC-3 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。SIME 對A549 細(xì)胞作用機(jī)制及其對其他腫瘤細(xì)胞的作用效果均有待進(jìn)一步研究。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，降低腫瘤細(xì)胞遷移能力是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。本試驗(yàn)通過劃痕試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SIME 能有效抑制A549 細(xì)胞的遷移。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移受多因素、多步驟調(diào)控，研究表明MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)水平與肺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。趙若琳等[29]試驗(yàn)表明桔梗皂苷D 抑制A549細(xì)胞粘附、 侵襲、 遷移與下調(diào)MMP-2、MMP-9 mRNA、 蛋白表達(dá)及抑制其上游ERK 信號通路和p-Akt 表達(dá)有關(guān)。SIME 對A549 細(xì)胞遷移的抑制作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究，同時，MMP-2 和MMP-9 表達(dá)受多個上游信號通路調(diào)控，信號中的關(guān)鍵靶蛋白及其對應(yīng)的靶基因也有待更深入的研究。

本試驗(yàn)對魷魚加工下腳料墨囊進(jìn)行利用，提取制備SIME，并探討SIME 對A549 細(xì)胞增殖及細(xì)胞遷移的影響。試驗(yàn)結(jié)果為魷魚墨等海洋資源加工副產(chǎn)物高值化利用提供了途徑，同時也為進(jìn)一步探討黑色素生物活性及作用機(jī)制提供了一定參考。