徐銘蔚，季曉紅，趙俊，周德明

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.北京林業(yè)大學(xué)微生物研究所，北京 100083；3.國(guó)家林業(yè)和草原局森林和草原病蟲(chóng)害防治總站，林業(yè)有害生物監(jiān)測(cè)預(yù)警國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

沙棘Hippophae rhamnoides是中國(guó)三北地區(qū)廣泛分布的一種落葉灌木，其根系發(fā)達(dá)，具有著生固氮根瘤的特性。此外，沙棘極具耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿的特性，因此被作為防風(fēng)固沙、保水保土、改良土壤的優(yōu)良樹(shù)種，在我國(guó)干旱地區(qū)水土保持和生態(tài)恢復(fù)中具有重要作用。沙棘果實(shí)內(nèi)含有極豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、糖類、鹽類和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出沙棘果汁、沙棘醋和沙棘果醬等產(chǎn)品；此外，沙棘果實(shí)還具有活血散淤、化痰寬胸、補(bǔ)脾健胃、生津止渴、清熱止瀉之效，同時(shí)對(duì)多種疾病都有一定的治療作用。目前中國(guó)沙棘林分總面積已達(dá)220 萬(wàn)hm2，具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益，但是近年來(lái)沙棘木材腐朽病害發(fā)生逐年擴(kuò)大。

國(guó)內(nèi)最早報(bào)道沙棘木材腐朽病的病原菌為稀木層孔菌Phellinus robustus(P.Karst.)Bourdot ＆Galzin[1-2]，但后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)稀木層孔菌只侵染櫟屬Q(mào)uercus樹(shù)木的主干，不侵染沙棘；在歐洲，生長(zhǎng)在沙棘上的病原腐朽菌為沙棘木層孔菌Phellinus hippophaeicolaH.Jahn[3]。因此中國(guó)西藏地區(qū)沙棘腐朽病原菌也曾鑒定為沙棘木層孔菌Phellinus hippophaeicola[4-5]和沙棘嗜藍(lán)孢孔菌Fomitiporia hippopha?icola(H.Jahn)Fiasson ＆ Niemel?[6]。但是隨著研究技術(shù)和手段的提高，特別是分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)造成中國(guó)沙棘腐朽病害的病原菌與歐洲的不同[7]，目前世界范圍內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)4 種病原菌[7-9]，即沙棘嗜藍(lán)孢孔菌Fomitiporiahippopha-eicola，羅布林卡藍(lán)孢孔菌Fomitiporia norbulingkaB.K.Cui ＆Hong Chen，擬沙棘嗜藍(lán)孢孔菌Fomitiporia subhippopha?icolaB.K.Cui ＆ H.Chen 和鼠李嗜藍(lán)孢孔菌Fomitiporia rhamnoidesT.Z.Liu ＆ F.Wu。

2018年夏季我們?cè)谇嗪Ｊ￠T(mén)源縣仙米森林公園調(diào)查森林病害時(shí)，發(fā)現(xiàn)公園內(nèi)的沙棘腐朽病害發(fā)生嚴(yán)重。為明確青海西北部沙棘立木腐朽病的病原菌，筆者對(duì)病原菌子實(shí)體進(jìn)行采集和分離，經(jīng)對(duì)樣品的分子序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確認(rèn)該地區(qū)沙棘腐朽病的病原菌為鼠李嗜藍(lán)孢孔菌Fomitiporia rhamnoides。鑒于國(guó)內(nèi)尚無(wú)對(duì)該病原菌的中文報(bào)道，根據(jù)已發(fā)表的英文文獻(xiàn)[9]描述了該病原菌的形態(tài)。

1 材料和方法

1.1 病原菌子實(shí)體采集 2018年在青海省門(mén)源縣仙米森林公園沙棘腐朽病發(fā)病區(qū)進(jìn)行樣品采集，共采集3個(gè)樣品，編號(hào)分別為ZHAO20180801、ZHAO 20180802 和 ZHAO20180803。

1.2 樣品DNA 提取 采用快速無(wú)毒試劑盒，取1.1 中干凈樣本約20～60 mg 研磨破碎后，編號(hào)備用。用CTAB 植物基因組DNA 快速提取試劑盒提取DNA，具體步驟如下:

1)準(zhǔn)備離心管，每號(hào)標(biāo)本1.5 mL 滅菌離心管3份，吸附柱AC 管1 份，均編號(hào)；

2)取400 μL 裂解液PL 分別加到編號(hào)的離心管中備用；

3)液氮研磨樣品，然后加到相應(yīng)的離心管中，65 ℃水浴30 min 或更長(zhǎng)時(shí)間；

4)加400 μL 氯仿異戊醇(氯仿和異戊醇配比為 24∶1)，12 000 r/min 離心 5 min；

5)預(yù)先在另1 組離心管中加入450 μL 的結(jié)合液PQ，取300 μL 上清液加入1個(gè)添加 PQ 的離心管中，混勻轉(zhuǎn)入AC 管中；

6)12 000 r/min 離心 30 s，棄廢液；

7)添加500 μL 抑制物去除液 IR，12 000 r/min離心30 s，棄廢液；

8)添加 500 μL 的漂洗液 WB，12 000 r/min 離心30 s，棄廢液；

9)再離心2 min，將吸附柱AC 轉(zhuǎn)入1個(gè)干凈的離心管中，自然晾干，約10 min 即可；

10)加入60～100 μL 的 Elution Buffer，室溫靜置3～5 min，12 000 r/min 離心 30 s，收集 DNA 備用。

1.3 樣品ITS 和nLSU 片段擴(kuò)增及測(cè)序

1.3.1 ITS 片段PCR 反應(yīng)程序 95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性 40 S，54 ℃復(fù)性 45 S，72 ℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸 10 min，4 ℃保溫。ITS 片段使用的引物為 ITS1(5′-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3′)和 ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)。

1.3.2 nLSU 片段 PCR 反應(yīng)程序 94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃ 變性 30 s，50 ℃ 復(fù)性 1 min，72 ℃ 延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。nLSU片段使用的引物為L(zhǎng)R0R(5′-ACC CGC TGA ACT TAA GC-3′)和 LR7(5′-TAC TAC CAC CAA GAT CT-3′)。

ITS 和 nLSU 的 PCR 反應(yīng)體系(30 μL):2 ×EasyTaq PCR SuperMix，15 μL；Primer1 (10 μmol/L)(正向)，1 μL；Primer2(10 μmol/L)(反向)，1 μL；Template DNA(75 ng/μL)，1 μL；ddH2O，12 μL。

1.3.3 測(cè)序 將所得樣品送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將這些新獲得的序列提交到GeneBank 數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 將nLSU 基因片段正反向序列拼接，用BioEdit 7.0.1[10]對(duì)所得序列進(jìn)行比對(duì)和編輯，用 ClustalX 2.0[11]轉(zhuǎn)化 Faster 序列文件為NEXUS 和 PHYLIP 格式文件[12]；用Phellinus uncisetus為ITS +nLSU 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的外群[13]；最大簡(jiǎn)約法(MP)采用 win-paup4b10 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[14]，最大似然法(ML)采用raxmlGUI 1.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[15-16]；用 GTR+I+G 模型 jModelTest 2.1.4篩選最佳模型[17-18]，用 MrBayes 3.1.2 貝葉斯法(BI)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[19]，GTR 模型作為最佳替代模型；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)用 Tree View 讀取并保存[20]。最大似然和最大簡(jiǎn)約支持概率(BS)不小于50%，貝葉斯后置概率(BPP)不小于0.90，則節(jié)點(diǎn)支持率可靠[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果 樣品 ZHAO20180801、ZHAO 20180802 和 ZHAO20180803 的 ITS/LSU 序列分別為 MK424367/MK430426，MK424368/MK430427和MK424369/MK430428。對(duì)這些序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確認(rèn)該地區(qū)沙棘腐朽病害的病原菌為鼠李嗜藍(lán)孢孔菌Fomitiporia rhamnoides(圖1)。鑒于國(guó)內(nèi)只在河北省對(duì)該種進(jìn)行過(guò)種類報(bào)道，并無(wú)該菌引起林木病害的報(bào)道[9]；在青海西北部尚無(wú)該真菌及其引起沙棘心材腐朽病害的報(bào)道[7-9]，因此本文是我國(guó)首次對(duì)該菌引起沙棘心材腐朽病害的研究報(bào)道，也是鼠李嗜藍(lán)孢孔菌在我國(guó)西北部的首次報(bào)道。

圖1 鼠李嗜藍(lán)孢孔菌的系統(tǒng)發(fā)育位置

2.2 形態(tài)描述 鼠李嗜藍(lán)孢孔菌Fomitiporia rhamnoidesT.Z.Liu ＆ F.Wu，in Liu，Chen，Han ＆Wu，MycoKeys 36:37(2018)

擔(dān)子果 多年生，通常生長(zhǎng)在樹(shù)干或樹(shù)枝上，無(wú)柄蓋形，單生或數(shù)個(gè)覆瓦狀疊生，新鮮時(shí)木栓質(zhì)，無(wú)特殊氣味，干后硬木質(zhì)，干后質(zhì)量中度變輕。菌蓋半圓形或蹄形，外伸可達(dá)8 cm，寬可達(dá)10 cm，基部厚5 cm。菌蓋表面黃褐色、灰褐色至黑褐色，具同心環(huán)溝，幼期被絨毛或茸毛，后期變光滑，隨年齡增加逐漸龜裂；邊緣鈍?？卓诒砻嫘迈r時(shí)灰黃至黃褐色，干后橘黃色至黃褐色，具折光反應(yīng)；不育邊緣薄，黃褐色，寬可達(dá)3 mm；孔口圓形，每毫米11～13個(gè)；孔口邊緣厚，全緣。菌肉黃褐色，具環(huán)區(qū)，硬木質(zhì)，厚可達(dá)2 cm。菌管灰褐色，比菌肉顏色淺，硬木栓質(zhì)至脆質(zhì)，分層不明顯，長(zhǎng)可達(dá)3 cm。(圖2)。

圖2 鼠李嗜藍(lán)孢孔菌的子實(shí)體

菌絲結(jié)構(gòu) 菌絲系統(tǒng)二體系；生殖菌絲具簡(jiǎn)單分隔；所有菌絲在Melzer 和棉蘭試劑中無(wú)變色反應(yīng)；在KOH 試劑中組織顏色變黑。

菌肉 生殖菌絲無(wú)色至淡黃色，薄壁或稍厚壁，偶爾分枝，頻繁分隔，直徑為3～4 μm；骨架菌絲黃褐色，厚壁，具寬的內(nèi)腔，不分枝，偶爾分隔，平直，規(guī)則排列，直徑為 4.5～6 μm。

菌管 生殖菌絲無(wú)色至淺黃色，薄壁，偶爾分枝，頻繁分隔，直徑為2～3 μm；骨架菌絲占多數(shù)，黃褐色，厚壁，具寬內(nèi)腔，不分枝，偶爾分隔，平直，沿菌管平行排列，直徑為2.5～4 μm。子實(shí)層中無(wú)剛毛；擬囊狀體中部腹鼓，無(wú)色，薄壁，大小為(12～20)μm ×(3～6)μm；擔(dān)子近球形至桶形，具 4 小梗，基部有一橫隔膜，大小為(8～16)μm × (6～10)μm；擬擔(dān)子在子實(shí)層中占多數(shù)，形狀與擔(dān)子相似，大小為(8～15)μm ×(6～9)μm；菱形或不規(guī)則型結(jié)晶體大量存在于子實(shí)層中。

孢子 擔(dān)孢子球形，無(wú)色，光滑，厚壁，在Melzer試劑中呈擬糊精反應(yīng)，在棉蘭試劑中其壁呈嗜蘭反應(yīng)，大小為(6～7.5)μm ×(5～6.5)μm，平均長(zhǎng)為6.69 μm，平均寬為6.20 μm，長(zhǎng)寬比為1.08。

3 結(jié)論和討論

首次報(bào)道鼠李嗜藍(lán)孢孔菌在我國(guó)青海西北部造成心材白色腐朽，該菌過(guò)去作為分類學(xué)種類僅在我國(guó)河北有報(bào)道，且未說(shuō)明該菌是否為病原菌。沙棘立木腐朽病主要發(fā)生在沙棘成熟林分內(nèi)，病原菌通過(guò)沙棘傷口侵染，最后風(fēng)折導(dǎo)致沙棘死亡。

鼠李嗜藍(lán)孢孔菌與沙棘嗜藍(lán)孢孔菌、羅布林卡藍(lán)孢孔菌和擬沙棘嗜藍(lán)孢孔菌都生長(zhǎng)在沙棘樹(shù)上，且都引起心材白色腐朽。沙棘嗜藍(lán)孢孔菌僅分布在歐洲，其孔口較大(每毫米5～7個(gè))，其他3 種的孔口較小(每毫米8～13個(gè))。擬沙棘嗜藍(lán)孢孔菌分布在西藏林芝地區(qū)，其主要特征是擔(dān)子果平伏反轉(zhuǎn)，而其他3 種的菌蓋為無(wú)柄蓋形。羅布林卡藍(lán)孢孔菌的主要特征是子實(shí)層無(wú)擬囊狀體，而其他3 種均具有擬囊狀體。鼠李嗜藍(lán)孢孔菌的主要特征是孔口最小(每毫米11～13個(gè))，且具有大量的菱形或不規(guī)則型結(jié)晶體存在于子實(shí)層中，而其他3 種的孔口為每毫米5～10個(gè)，且在子實(shí)層中無(wú)菱形或不規(guī)則型結(jié)晶體存在。因此從形態(tài)上也能區(qū)分這個(gè)4 種病原菌。此外，最重要的是這4 種病原菌的分子序列不同，因此從序列上很容易對(duì)比而區(qū)分。

鼠李嗜藍(lán)孢孔菌在我國(guó)西北部的子實(shí)體比在河北地區(qū)的稍大，孔口較淺，但分子序列與模式材料的一致，兩者在在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚在同一分支，且獲得高支持率，因此青海西北部沙棘腐朽病的病原是鼠李嗜藍(lán)孢孔菌。該菌在青海西北部沙棘林分造成嚴(yán)重病害，我們所調(diào)查的林分發(fā)病率高達(dá)60%以上，沙棘單株樹(shù)木上可產(chǎn)生多個(gè)子實(shí)體，受害樹(shù)木在初期影響生長(zhǎng)，后期心材嚴(yán)重腐朽，通常風(fēng)折死亡，但也可直接造成沙棘死亡。