胡萍 韋芳 顧青 曹陽 田敏 呂紅彬

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，是工作人群視力損害和致盲的主要原因[1]。目前認(rèn)為，糖尿病患者長期慢性高血糖是引起DR病理改變的主要原因[2]。DR晚期常有視網(wǎng)膜異常新生血管形成[3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞在新生血管形成中起重要作用，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移可形成毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)，為新生血管形成提供條件[4]。供應(yīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞活動(dòng)的85%ATP來自于糖酵解，糖酵解的主要調(diào)節(jié)劑為6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶(6-phosphofructokinase-2/fructose-2，6-bisphosphatase 3，PFKFB3)[5]。PFKFB3在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)[6]，PFKFB3 的抑制劑3-(3-吡啶基)-1-(4-吡啶基)-2-丙烯-1-酮[3-(3-pyridinyl)-1-(4-pyridinyl)-2-propen-1-one，3PO]可降低糖酵解速率，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，減少血管萌芽[5，7]。本課題組前期研究表明，PFKFB3在DR患者玻璃體和血清中以及糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)均升高[8-9]。然而，高糖環(huán)境下抑制PFKFB3對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成的作用尚不明確。本研究通過體外高糖環(huán)境模擬糖尿病狀態(tài)，探討應(yīng)用3PO抑制PFKFB3對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用及其機(jī)制，為DR的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC；美國ScienCell公司)；細(xì)胞外基質(zhì)培養(yǎng)基 (美國Gibco公司)；基質(zhì)膠 (美國Corning公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Real-time PCR試劑盒(日本Takara公司)；PFKFB3抗體 (英國Abcam公司)；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(phospha-extracellular signal-regulated kinase，p-ERK) 抗體和β-actin抗體(美國CST公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Millipore公司)；倒置顯微鏡(日本 Olympus 公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、垂直電泳儀(美國Bio-Rad 公司)；凝膠成像儀(美國General Electric 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組將HUVEC復(fù)蘇，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后接種于培養(yǎng)皿，加入ECM培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。將傳代培養(yǎng)的HUVEC隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組 (5.5 mmol·L-1葡萄糖)、高滲組 (5.5 mmol·L-1葡萄糖+24.5 mmol·L-1甘露醇)、高糖組 (30.0 mmol·L-1葡萄糖)及高糖+3PO組(30.0 mmol·L-1葡萄糖+10.0 μmol·L-13PO)。細(xì)胞同步化后按分組情況更換相應(yīng)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTS實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況將對(duì)數(shù)生長期的HUVEC以每孔20×103個(gè)接種于96孔板，按分組情況更換培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h和48 h后每孔加入20 μL MTS溶液，重新放回培養(yǎng)箱孵育2～4 h后，用酶標(biāo)儀于490 nm測定每孔的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將對(duì)數(shù)生長期的HUVEC以每孔200×103個(gè)接種于12孔板，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿融合成單層細(xì)胞后，用200 μL微量加樣槍頭垂直在培養(yǎng)孔中央劃一條直線，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞兩遍，按照各組處理要求加入相應(yīng)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下分別于24 h、48 h 觀察細(xì)胞從劃痕處向外遷移的面積。在0 h、24 h及48 h隨機(jī)選取 6個(gè)視野進(jìn)行拍照，采用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算遷移面積的百分比作為各組細(xì)胞遷移率。

1.2.4 體外管腔形成實(shí)驗(yàn)將無菌槍頭及96孔板置于-20 ℃冰箱過夜，基質(zhì)膠置于4 ℃冰箱中融化?；|(zhì)膠置于冰浴中，用預(yù)冷的槍頭將基質(zhì)膠緩慢鋪于96孔板中，每孔50 μL，水平放入培養(yǎng)箱中靜置30 min使基質(zhì)膠凝固。將細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后加入各組培養(yǎng)基，混勻后每孔加入100 μL的細(xì)胞懸液 (20×103個(gè)細(xì)胞)，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，觀察各組細(xì)胞成管數(shù)量、完整程度及管狀結(jié)構(gòu)排列情況等，并隨機(jī)選擇6個(gè)視野拍照，應(yīng)用Image J軟件分析細(xì)胞成管長度。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測分組處理HUVEC 48 h，Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR法擴(kuò)增cDNA，反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，58.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以β-actin為內(nèi)參，采用公式△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=Ct實(shí)驗(yàn)組-Ct對(duì)照組，計(jì)算2-△△Ct，得出目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：PFKFB3：正向：5’-CTTGTCGCTGATCAAGGTGA-3’，反向：5’-TTCTGCTCCTCCACGAACTT-3’；β-actin：正向：5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3，反向：5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)按分組處理HUVEC 48 h，提取細(xì)胞總蛋白，每孔中取相同量上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。濃縮膠 80 V，分離膠120 V，360 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h。置于脫脂牛奶內(nèi)室溫?fù)u床上封閉2 h，稀釋一抗(11000)，4 ℃孵育過夜，室溫?fù)u床上 TBST洗3次，每次15 min。稀釋二抗 (15000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次15 min，將PVDF膜蛋白面與ECL顯影液接觸，凝膠成像儀顯影成像，采用Image J軟件分析處理，計(jì)算各目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較各組間細(xì)胞增殖率總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，高滲組細(xì)胞增殖能力降低(均為P<0.05)；24 h高糖組細(xì)胞增殖能力無明顯升高(P>0.05)，48 h高糖組細(xì)胞增殖能力升高(P<0.05)。與高糖組相比，高糖+3PO組細(xì)胞增殖能力明顯被抑制(均為P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖率、細(xì)胞遷移率及管腔形成長度

組別細(xì)胞增殖率/%24 h48 h細(xì)胞遷移率/%24 h48 h管腔形成長度/像素正常對(duì)照組1.00±0.021.00±0.0217.14±1.6133.38±1.7117 980.0±688.7高滲組0.94±0.030.95±0.0232.13±3.4460.24±3.8510 070.0±543.2高糖組1.04±0.041.06±0.0425.24±3.0134.99±3.7212 450.0±158.7高糖+3PO組0.65±0.040.71±0.0313.30±2.2419.54±2.928692.0±797.0F值145.39193.349.8228.7146.01P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

2.2 各組細(xì)胞遷移能力比較各組間細(xì)胞遷移率總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，高滲組細(xì)胞遷移率明顯升高(均為P<0.05)；24 h高糖組細(xì)胞遷移率明顯升高(P<0.05)，但在48 h高糖組中細(xì)胞遷移率升高不明顯(P>0.05)。與高糖組相比，高糖+3PO組細(xì)胞遷移率明顯降低(均為P<0.05)。見表1、圖1。

2.3 各組細(xì)胞管腔形成能力比較各組間細(xì)胞管腔形成長度總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，高滲組及高糖組細(xì)胞管腔形成能力均明顯減弱(均為P<0.05)。與高糖組相比，高糖+3PO組細(xì)胞管腔形成能力減弱(P<0.05)。見表1、圖2。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組HUVEC中PFKFB3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量各組間PFKFB3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.00，P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，高滲組PFKFB3 mRNA的表達(dá)水平變化不大(P>0.05)，高糖組PFKFB3 mRNA的表達(dá)升高(P<0.05)。與高糖組相比，高糖+3PO組 PFKFB3 mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖3。

圖1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移率

圖2 體外管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞管腔形成情況。A：正常對(duì)照組；B：高滲組；C：高糖組；D：高糖+3PO組

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組HUVEC中PFKFB3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(*P<0.05)

2.5 Western blot檢測各組HUVEC中各蛋白相對(duì)表達(dá)量各組間p-ERK/ERK蛋白比值及PFKFB3蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p-ERK/ERK：F=11.54，P<0.05；PFKFB3：F=99.81，P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，高滲組及高糖組中p-ERK/ERK蛋白比值及PFKFB3蛋白表達(dá)均升高(均為P<0.05)。與高糖組相比，高糖+3PO組p-ERK /ERK蛋白比值及PFKFB3蛋白表達(dá)下降(均為P<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測各組HUVEC中各蛋白表達(dá)水平

3 討論

DR是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，已成為中老年人致盲的重要原因之一，嚴(yán)重影響患者的健康及生活質(zhì)量[10]。長期慢性高血糖是DR微血管病變發(fā)生發(fā)展的重要致病因素。長期高血糖可引起局部視網(wǎng)膜組織缺血缺氧，導(dǎo)致視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞凋亡增加、內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移及基底膜增厚等一系列病理改變，從而使視網(wǎng)膜微血管管腔狹窄。同時(shí)高血糖引起的血流動(dòng)力學(xué)改變加重視網(wǎng)膜毛細(xì)血管閉塞，進(jìn)一步加劇視網(wǎng)膜組織缺血缺氧，最終促使視網(wǎng)膜大量新生血管形成[11]，導(dǎo)致增生型DR發(fā)生[12]，甚至出現(xiàn)玻璃體積血、牽拉性視網(wǎng)膜脫離和新生血管性青光眼等并發(fā)癥，最終導(dǎo)致DR患者失明[4]。目前，視網(wǎng)膜激光光凝、抗血管內(nèi)皮生長因子藥物和玻璃體切割術(shù)雖然對(duì)DR有一定的療效，能在一定程度上延緩DR進(jìn)展，但這些方法費(fèi)用較高且對(duì)視網(wǎng)膜健康組織有一定損傷，治療后易復(fù)發(fā)，甚至造成眼部不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，進(jìn)一步尋找相對(duì)低廉且安全有效的藥物或新靶點(diǎn)來防治DR成為DR的研究熱點(diǎn)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移在新生血管形成過程中至關(guān)重要。內(nèi)皮細(xì)胞具有高糖酵解活性，其增殖和遷移所需的大部分能量依賴于糖酵解過程[5]。作為糖酵解關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑的PFKFB3是PFKFB家族的成員之一，具有顯著的激酶活性，可正向調(diào)節(jié)葡萄糖攝取，增加果糖-2，6-二磷酸和乳酸的產(chǎn)量[13]。有研究顯示，PFKFB3可增強(qiáng)糖酵解，加速細(xì)胞周期，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成[5，7，14]以及多種腫瘤生長[15]等，敲除PFKFB3后的內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)外均難以生成血管[6]，采用PFKFB3抑制劑 3PO可降低內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解速率，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，從而減少血管萌芽[7]。本研究結(jié)果顯示，3PO抑制PFKFB3后，高糖環(huán)境下的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成能力明顯減弱，幾乎不能形成完整管腔，這與Schoors等[7]在腫瘤環(huán)境中的研究結(jié)果相似，說明當(dāng)3PO抑制高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解代謝過程時(shí)，新生血管形成能力將明顯減弱。

高糖培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞是體外模擬DR病理狀態(tài)的常用方式，但高糖環(huán)境對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成的影響卻不盡相同。本研究結(jié)果顯示，24 h時(shí)高糖環(huán)境可誘導(dǎo)HUVEC遷移能力升高，但對(duì)其增殖能力尚無明顯作用；48 h時(shí)高糖環(huán)境可使HUVEC增殖能力升高，但對(duì)其遷移能力卻無明顯作用，說明在較短時(shí)間內(nèi)高糖環(huán)境主要誘導(dǎo)遷移能力升高，在相對(duì)長的時(shí)間內(nèi)主要引起增殖能力增強(qiáng)，這與Zhou等[16]研究結(jié)果有部分相似之處。本研究表明，高糖及高滲環(huán)境均削弱細(xì)胞的成管能力，且高糖環(huán)境對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力損傷更大，這與Zhou等[16]及Xing等[17]部分研究結(jié)果相似。原因可能與實(shí)驗(yàn)條件如細(xì)胞的培養(yǎng)代數(shù)、葡萄糖處理前的細(xì)胞狀態(tài)、葡萄糖濃度和作用時(shí)間等不盡相同有關(guān)[18]。大血管內(nèi)皮細(xì)胞與微血管內(nèi)皮細(xì)胞盡管都屬于血管內(nèi)皮細(xì)胞，但在高糖環(huán)境下細(xì)胞功能及表型等存在差異[19]。本研究采用濃度匹配的甘露醇作為高滲透壓對(duì)照，發(fā)現(xiàn)滲透壓變化和高糖環(huán)境對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和管腔形成的影響不完全一致，猜測高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成的作用少部分由高滲透壓引起，但更多的影響是高糖通過調(diào)控各種因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)起作用。

已有研究證實(shí)，MAPK/ERK通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，以響應(yīng)血管內(nèi)皮生長因子刺激、缺氧等細(xì)胞外環(huán)境變化，其強(qiáng)效抑制劑PD98059可阻斷ERK活化，減弱HUVEC的增殖和遷移能力[20]。本研究結(jié)果表明，高糖環(huán)境下ERK的活性明顯增加，當(dāng)采用3PO抑制PFKFB3后其活化被明顯抑制，從而減弱HUVEC的增殖和遷移能力。有研究表明，PFKFB3在多種腫瘤中表達(dá)升高，對(duì)腫瘤中新生血管的形成起重要作用[15]。本課題組前期研究表明，增生型DR患者玻璃體和血清中的PFKFB3水平較對(duì)照組升高[8]，2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中PFKFB3表達(dá)較對(duì)照組升高，且PFKFB3主要表達(dá)于視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)高糖環(huán)境作用于HUVEC，觀察到高糖環(huán)境下PFKFB3的mRNA及蛋白表達(dá)以及ERK蛋白活性均升高，當(dāng)采用3PO處理細(xì)胞后PFKFB3的mRNA及蛋白表達(dá)和ERK蛋白活性則降低，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管腔形成能力也減弱，說明抑制PFKFB3對(duì)高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成能力均有影響，抑制新生血管形成，其作用機(jī)制可能與MAPK/ERK信號(hào)通路影響有關(guān)。