小麥黃花葉病毒P3蛋白致病功能域的鑒定和分析

張 巖，亓玉華，魯燕華，楊乾坤，何雨娟，李俊敏，3，陳劍平，3，*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002； 2.浙江省植物有害生物防控國家重點實驗室培育基地，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部/浙江省植保生物技術(shù)重點實驗室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310021； 3.寧波大學(xué) 植物病毒學(xué)研究所，浙江 寧波 315211)

我國土傳小麥黃花葉病的病原主要為馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)的小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic virus，WYMV)[1]。WYMV由土壤中的禾谷多黏菌(Polymyxagraminis)傳播，廣泛分布于我國安徽、河南、江蘇、湖北、陜西、四川和山東等冬小麥區(qū)[2]。由于我國的WYMV和國外發(fā)現(xiàn)報道的另一種同屬的小麥梭條斑花葉病毒(Wheat spindle streak mosaic virus，WSSMV)十分相似，之前在日本、印度和中國被認(rèn)為是引起小麥黃花葉病害的第二個病毒[3-5]。1994年Sohn等[6]報道了WSSMV法國分離物RNA1 3’端4 kb序列，1995年于嘉林等[7]報道了一個中國河南分離物RNA1 3’末端的891個核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)與法國分離物僅有69.9%的序列同源性。隨后，1998年Namba等[8]報道了日本W(wǎng)YMV基因組全長序列，與法國分離物相比，也僅有69.8%的同源性，從而表明它們是不同的病毒，在我國和日本造成小麥黃花葉病的大麥黃花葉病毒屬病毒為WYMV。WYMV在小麥苗期侵染但不顯癥，通常在2月中下旬當(dāng)氣溫升到6 ℃左右時開始出現(xiàn)癥狀，3月中下旬為發(fā)生盛期。氣溫升至15 ℃以上時出現(xiàn)隱癥，20 ℃以上病情會停止發(fā)展，但發(fā)病對產(chǎn)量造成的損失仍然存在，嚴(yán)重影響我國冬麥區(qū)小麥的安全生產(chǎn)[2]。

WYMV由RNA1和RNA2兩條正義單鏈線性RNA組成。RNA1全長7 635個核苷酸，只包含一個編碼269 ku的多聚蛋白開放閱讀框(open reading frame，ORF)，經(jīng)蛋白酶切割后形成8個成熟的蛋白，分別簡稱為P3、7K、CI、14K、VPg、NIa、NIb以及CP[9]。此外，在P3中還可以通過+2移碼產(chǎn)生PIPO蛋白。RNA1的5’和3’末端非編碼區(qū)分別為162和258個核苷酸。RNA2全長3 650個核苷酸，整個基因組也僅有一個ORF，編碼一個約100 ku的多聚蛋白，通過切割產(chǎn)生2個成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白P1和P2。RNA2的5’UTR和3’UTR分別為171和767個核苷酸[2]。

P3氨基酸序列在馬鈴薯Y病毒科中具有較高保守性，研究表明，P3蛋白在病毒復(fù)制[10]、致病性[11-12]、克服宿主抗性[13]、細(xì)胞間移動[14-15]等方面均具有重要作用。利用野生型的馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)分離物Tu-3和Tu-2R1構(gòu)建侵染性克隆，實驗結(jié)果表明，交換分離物的P3部分序列后對兩種病毒在甘藍(lán)和蘿卜上的癥狀產(chǎn)生顯著影響，表明P3對TuMV在宿主植物上的致病性具有明顯影響[16]。同時，研究表明P3 碳端(P3-C)對馬鈴薯Y病毒屬的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticum，ER)定位和致病性有決定性作用。木瓜環(huán)斑病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)的P3-C末端具有ER定位信號，對P3的功能有重要作用[17]。雖然P3在馬鈴薯Y病毒屬中的功能已有較多研究，但大麥黃花葉病毒屬中的P3是否有類似功能目前還未見報道。本研究對WYMV的P3功能進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步深入理解土傳病毒的致病機(jī)理提供了新的信息。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：感染W(wǎng)YMV的小麥樣品于本實驗室-80 ℃冰箱保存，RT-PCR檢測確認(rèn)帶毒情況；野生型本氏煙于本實驗室溫室種植，將小苗移植于營養(yǎng)土∶珍珠巖∶蛭石(體積比)為3∶1∶1的土壤中，24 ℃，光照16 h/黑暗8 h處理條件下培育。

菌株與載體：大腸埃希菌感受態(tài)(DH5α)購于南京百思禾生物科技有限公司；農(nóng)桿菌感受態(tài)(GV3101)購于上海唯地生物技術(shù)有限公司；煙草脆裂病毒侵染性克隆載體為本實驗室保存菌株。

1.2 試劑

瓊脂糖購于翊圣生物公司；KOD FX Neo高保真擴(kuò)增酶和Ligation version.2購于TOYOBO公司；Thermosensitive Alkaline Phosphatase和Therno Scientific FastDigestPstⅠ購于fermentas公司；RNA提取試劑：Trizol試劑盒購于賽默飛生物公司，氯仿購于上海凌風(fēng)化學(xué)試劑有限公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生物公司；RT-qPCR試劑ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix購于諾唯贊生物公司；DNA Marker、RNA Free H2O、TAE緩沖液等購自上海生工生物公司；乙醇等其他試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3 WYMV P3蛋白相關(guān)基因克隆

從NCBI下載WYMV P3基因序列(NCBI登錄號AJ131982.1)，根據(jù)DNAMAN軟件預(yù)測P3基因的跨膜結(jié)構(gòu)域(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，分別設(shè)計P3和P3碳端(P3-C，位于P3的712-981個核苷酸)、P3-C缺失單個跨膜結(jié)構(gòu)域(P3-C-dN、P3-C-dC)的上下游引物，下劃線為PstⅠ識別位點(表1)。

以Trizol法(具體方法參照Invitrogen公司的RNA提取試劑盒說明)提取WYMV侵染的小麥葉片RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增出P3以及P3-C特異基因片段，割膠回收PCR產(chǎn)物。

1.4 TRV載體構(gòu)建

將含有沉默載體的質(zhì)粒按照總體積60 μL體系進(jìn)行單酶切處理，其中含抽純質(zhì)粒30 μL，F(xiàn)ast Green Buffer 6 μL，PstⅠ2 μL，其余用ddH2O補(bǔ)足。

其中載體質(zhì)粒經(jīng)酶切37 ℃處理30 min后，需加入去磷酸化酶Thermosensitive Alkaline Phosphatase以防止其發(fā)生自連，37 ℃再處理30 min后進(jìn)行切膠回收備用。表達(dá)載體總體積15.0 μL，含單酶切目的基因產(chǎn)物6.5 μL，表達(dá)載體單酶切產(chǎn)物1.0 μL，Ligation version.2 7.5 μL。于16 ℃連接12 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞并涂布在含有卡納霉素(Kan，50 μg·mL-1)抗性的平板上篩選陽性克隆，陽性克隆經(jīng)PCR鑒定后，將含有目的基因的菌液送往擎科生物公司進(jìn)行DNA測序，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒。

1.5 P3及P3-C致病性分析

將測序成功質(zhì)粒(P3、P3-C、P3-C-dN、P3-C-dC)使用電擊法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101菌株，2 d后經(jīng)菌落PCR鑒定成功后挑取單菌落搖菌，集菌后用緩沖液(10 mmol·L-1pH 5.8的MES、10 mmol·L-1MgCl2和200 μmol·L-1乙酰丁香酮)重懸農(nóng)桿菌沉淀，28 ℃靜置2 h注射9或10葉期的本氏煙。注射后持續(xù)觀察煙草癥狀表現(xiàn)。

表1 引物列表

P3為完整蛋白，P3-C為P3的712-981個核苷酸，P3-C-dN和P3-C-dC分別為P3-C缺失N段的跨膜結(jié)構(gòu)域和缺失C端的跨膜結(jié)構(gòu)域片段。

P3 indicated the complete protein; P3-C indicated the region of 712-981 of P3; P3-C-dN indicated the transmembrane domain of P3-C with N-terminal deletion; P3-C-dC were the transmembrane domain of P3-C with C-terminal deletion.

1.6 P3-C移碼突變

將WYMV P3-C肽段中第一個翻譯起始密碼子ATG之后的第一個堿基進(jìn)行缺失突變，使后續(xù)的氨基酸發(fā)生移碼突變。利用移碼突變后的P3-C基因序列構(gòu)建TRV重組載體，經(jīng)農(nóng)桿菌浸潤后，持續(xù)觀察本氏煙的癥狀。

1.7 P3-C跨膜結(jié)構(gòu)域突變

為了研究P3-C兩個跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD1和TMD2)對P3-C功能的重要性，我們將TMD1和TMD2中的重要氨基酸用脯氨酸替代，從而破壞跨膜結(jié)構(gòu)域的功能。突變被設(shè)計為減少TMD的疏水性，將TMD1中的2個亮氨酸以及一個酪氨酸(LLY)，TMD2中異亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸以及亮氨酸(IYFL)分別用連續(xù)的脯氨酸替代產(chǎn)生mP3-C突變體。另外，我們同時設(shè)計了分別缺失TMD1和TMD2的2個突變體，命名為P3-C-dN和P3-C-dC。利用突變后的基因序列分別構(gòu)建TRV重組載體，經(jīng)農(nóng)桿菌浸潤后，持續(xù)觀察本氏煙的癥狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 WYMV P3及P3-C基因克隆與序列分析

為獲取P3及P3-C目的片段，從WYMV侵染的小麥葉片中提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增得到了WYMV P3(TRV-WYMV-P3-F/R)及P3-C(TRV-WYMV-P3-C(712)-F/P3-R)cDNA片段(圖1-A)，割膠回收PCR產(chǎn)物并將其分別構(gòu)建到PstⅠ酶切的TRV載體上，PCR檢測并挑取陽性克隆送測。測序結(jié)果表明，P3基因全長由981個核苷酸組成，共編碼327個氨基酸，P3-C核苷酸長度為270，編碼90個氨基酸。通過NCBI BLAST同源比對明確了擴(kuò)增的確實為WYMV P3序列。經(jīng)DNAMAN蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，P3編碼的蛋白氨基酸含有多個疏水性區(qū)域，且含有3個跨膜結(jié)構(gòu)域，P3-C(712-981)含有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1-B)。

2.2 WYMV P3-C在本氏煙上具有致病效應(yīng)

將P3及P3-C成功構(gòu)建到TRV載體后，與TRV-RNA1農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙植株。結(jié)果表明，農(nóng)桿菌浸潤5 d后，與對照組相比，TRV-P3-C在浸潤煙草2 d時(圖2-A、D)，接種葉即開始出現(xiàn)萎蔫失水，接種后4 d接種葉片壞死且緊挨接種葉的莖部開始萎蔫壞死(圖2-B、E)，接種5 d整個莖部進(jìn)入失水萎蔫壞死狀態(tài)，植株已無法正常生長發(fā)育，直至整株植物死亡(圖2-F)。有意思的是，構(gòu)建的P3全長載體TRV-P3與對照組相比則沒有明顯表型差異，均未引起本氏煙致病表型(圖2-C)。

2.3 P3-C的致病有效因子為多肽

由于P3-C致病性可能由病毒來源的小干擾RNA或病毒編碼的多肽引起，為進(jìn)一步明確P3-C致病性是否由P3-C編碼的氨基酸引起，我們將P3-C進(jìn)行移碼突變，并命名為P3-C-FM(圖3-A)。通過農(nóng)桿菌侵染本氏煙5 d后觀察癥狀，結(jié)果表明移碼突變后的P3-C(即P3-C-FM)和對照癥狀類似，無法在本氏煙上引起P3-C的萎蔫壞死表型(圖3-D)，表明P3-C的致病性確實是由其編碼的氨基酸引起的。

M，DNA marker；泳道1，WYMV P3；泳道2，WYMV P3-C。M， DNA marker; Lane 1， WYMV P3; Lane 2， WYMV P3-C.圖1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果(A)及P3編碼的氨基酸序列分析和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(B)Fig.1 RT-PCR results (A) and sequence analysis of P3 protein and prediction of its transmembrane domains (B)

A-B，TRV-GUS分別侵染煙草2和5 d癥狀圖，作為陰性對照；C，TRV-P3癥狀圖；D-F，TRV-P3-C分別侵染煙草2、4和5 d癥狀圖。A-B， Symptoms of N. benthamiana induced by expression of GUS gene(negative control) for two and five days after injection; C， Symptoms of TRV-P3; D-F， Symptoms of N. benthamiana induced by expression of P3-C for two， four and five days after injection.圖2 TRV分別表達(dá)WYMV P3和P3-C在本氏煙上引起的癥狀Fig.2 Symptoms of N. benthamiana induced by expression of WYMV P3 and P3-C in a TRV vector

2.4 跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)YMV P3-C的致病性具有重要作用

為研究P3-C兩個跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD1和TMD2)對P3-C功能的重要性，我們將P3-C中兩個跨膜結(jié)構(gòu)域中疏水性氨基酸用脯氨酸替代，重新構(gòu)建TRV-mP3-C重組載體(圖4-A)。同時，我們還將兩個跨膜結(jié)構(gòu)域分別單獨缺失，構(gòu)建突變體TRV-P3-C-dN和TRV-P3-C-dC(圖4-A)。農(nóng)桿菌浸潤后持續(xù)觀察本氏煙上引起的癥狀，結(jié)果表明，浸潤5 d后無論是TRV-mP3-C還是TRV-P3-C-dN/TRV-P3-C-dC均和對照類似，無明顯癥狀，不具備致病性(圖4-B)，表明這兩個跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)YMV P3-C的致病性均有十分重要的作用。

3 討論

植物病毒編碼的復(fù)制酶、運(yùn)動蛋白、外殼蛋白等均有可能是病毒的致病因子，多種植物病毒中曾報道過復(fù)制酶導(dǎo)致的寄主致病性[18]。同時有研究表明，寄主RNA干擾產(chǎn)生的病毒來源的小干擾RNA除剪切病毒自身基因組外，也可能靶向寄主內(nèi)源性靶標(biāo)并對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，導(dǎo)致寄主癥狀的產(chǎn)生[19-20]。由于WYMV在小麥上的研究缺乏反向遺傳學(xué)工具，同時禾谷多黏菌傳毒體系在室內(nèi)建立較困難，因此目前WYMV的相關(guān)研究進(jìn)展較慢。本研究利用TRV介導(dǎo)的本氏煙基因沉默系統(tǒng)，明確了WYMV的P3碳端在本氏煙上具有致病相關(guān)功能域P3-C，且其致病性是由多肽引起的，同時其兩個跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)χ虏⌒跃哂兄匾饔?，有助于后續(xù)對WYMV致病機(jī)理的深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)，P3-C在本氏煙上有致病活性，而完整P3蛋白則不具備，推測是由于P3-C比P3缺少一個跨膜結(jié)構(gòu)域，P3-N端的區(qū)域在結(jié)構(gòu)上可能會掩蓋P3-C端的致病能力，這一推測還有待進(jìn)一步實驗驗證。

A，P3-C移碼突變示意圖；B，TRV-GUS為陰性對照；C，TRV-P3-C為陽性對照；D，TRV-P3-C移碼突變(TRV-P3-C-FM)癥狀圖。A， Schematic diagram of P3-C frame shift mutation; B， TRV-GUS was used as a negative control; C， TRV-P3-C was used as a positive control; D， TRV-P3-C frame shift mutation (TRV-P3-C-FM) symptom.圖3 移碼突變示意圖及煙草癥狀圖Fig.3 Schematic diagram of frame shift mutations and the symptoms of infected N. benthamiana

A，P3-C跨膜結(jié)構(gòu)域突變示意圖；B，TRV-GUS為陰性對照；C，TRV-P3-C為陽性對照；D、F，P3-C跨膜結(jié)構(gòu)域突變癥狀圖。A， Schematic diagram of P3-C frame shift mutation; B， TRV-GUS was used as a negative control; C， TRV-P3-C was used as a positive control; D-F， P3-C transmembrane domain mutation symptom.圖4 跨膜結(jié)構(gòu)域突變示意圖及煙草癥狀圖Fig.4 Schematic diagram of transmembrane domain mutations and the symptoms of N. benthamiana

先前研究表明，P3氨基酸序列在馬鈴薯Y病毒屬中具有較高保守性，P3氨基酸序列在WYMV不同分離物中也具有很高保守性(未發(fā)表數(shù)據(jù))，這可能和P3在病毒侵染過程中具有多種重要功能有一定關(guān)系。已有研究表明，P3蛋白除了對宿主具有致病性外，其在病毒的復(fù)制[10]，克服宿主抗性[11-12]，細(xì)胞間移動[14-15]等方面均有重要功能。與WYMV同一家族中的不同病毒相比，不同病毒編碼的P3在寄主內(nèi)的亞細(xì)胞定位有所不同。如煙草葉脈斑點病毒(Tobacco vein mottling virus，TVMV)的P3蛋白與CI蛋白在寄主的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生相互互作[21]，而煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus，TEV)的P3蛋白則在細(xì)胞核內(nèi)與病毒編碼的NIb和NIa蛋白發(fā)生互作[22]。這些現(xiàn)象表明，不同病毒的P3蛋白可能在寄主中發(fā)揮不同功能，而WYMV病毒P3蛋白在寄主內(nèi)的亞細(xì)胞定位情況及發(fā)揮的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步的探索研究。