小鼠雞卵巢顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的比較與優(yōu)化

扆妍妍,侯雅鑫,張宇瞳,孫 娜,孫耀貴,李宏全

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山西 太谷 030801)

卵巢顆粒細(xì)胞是組成卵泡的重要體細(xì)胞,主要參與調(diào)控卵泡生長發(fā)育、類固醇激素生成等重要生理過程[1-4]。在動(dòng)物一生中,卵巢不同發(fā)育階段的超過99%的卵泡將在排卵前發(fā)生退化或卵泡閉鎖,只有大約1%的卵泡能成功排卵[5]。而顆粒細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是卵巢卵泡閉鎖的主要機(jī)制,在卵泡命運(yùn)中起關(guān)鍵作用[6]。同時(shí)顆粒細(xì)胞的異常會(huì)引起不同生殖疾病,對于畜禽繁殖造成極大的影響[7-8]。因此顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)對于研究畜禽生殖疾病等至關(guān)重要。本試驗(yàn)通過體外培養(yǎng)小鼠、雞不同等級卵泡顆粒細(xì)胞,分析不同種屬動(dòng)物體外分離、培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的方法差異,并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化,為培養(yǎng)不同畜禽卵巢顆粒細(xì)胞提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3周齡雌性昆明系小鼠,SPF級,由北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場提供。200日齡海藍(lán)褐蛋雞,由太谷縣北洸規(guī)范化商品蛋雞養(yǎng)殖場提供。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器 孕馬血清促性腺激素,購自寧波三生藥業(yè)有限公司；DME/F-12 1∶1(1X)培養(yǎng)基和M199培養(yǎng)基,購自Hyclone公司；Ⅱ型膠原酶、鼠尾膠原、青鏈霉素混合液、細(xì)胞組織固定液、正常山羊血清、Triton-100,購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清,購自以色列Biological Industries公司；激光共聚焦35皿,購自NEST公司；Mouse Anti-rabbit IgG/FITC antibody、FSHR Antibody Rabbit Polyclonal,購自武漢 Proteintech公司；DAPI染色液,購自Beyotime公司；主要儀器有離心機(jī)(德國Sigma公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；CO2培養(yǎng)箱(中國 Heal force 公司)。

1.3 主要試劑配制 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)-完全培養(yǎng)基：DME/F-12 1∶1(1X)+10% 胎牛血清+1%青鏈霉素混合液；操作液；DME/F-12 1∶1(1X)+3%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液；雞卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)；完全培養(yǎng)基：M199+10% 胎牛血清+1%青鏈霉素混合液。

1.4 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng) 選取發(fā)情前期的3周齡雌性昆明系小鼠,腹腔注射8 IU孕馬血清促性腺激素(PMSG),46～48 h后頸椎脫臼處死,75%酒精棉球腹部消毒；無菌條件下將小鼠沿腹中線處剪開,充分暴露腹部,切開腹膜,將內(nèi)臟向上翻,暴露兩側(cè)卵巢和輸卵管；用眼科鑷夾住子宮與輸卵管連接部位,將包裹卵巢的膜撕開,眼科鑷夾住,即可取出雙側(cè)卵巢,迅速放入含有PBS(37℃預(yù)熱)的35 mm培養(yǎng)皿中,用PBS清洗3次,轉(zhuǎn)入含有操作液的35 mm培養(yǎng)皿中,若所需卵巢數(shù)量較多,采集應(yīng)分批進(jìn)行并將已采集卵巢組織置于37℃培養(yǎng)箱中保存；用1 mL的注射器針頭刺破卵巢上卵泡,使得顆粒細(xì)胞釋放出來；200目過濾操作液,1 000 r/min離心5 min,棄上清,PBS清洗3次,1000 r/min離心5 min,加入完全培養(yǎng)基DMEM/F12重懸；吸取臺(tái)盼藍(lán)溶液按1∶9比例加入細(xì)胞懸液中染色,血球計(jì)數(shù)板計(jì)活細(xì)胞數(shù),調(diào)整細(xì)胞數(shù)量,按照5×105/mL細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,混勻,放置在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后觀察細(xì)胞貼壁及生長情況。

1.5 雞等級卵泡顆粒細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng) 產(chǎn)蛋高峰期蛋雞,禁食禁水12 h,頸靜脈放血致死,取出卵巢組織,生理鹽水清洗3遍,置于盛有預(yù)冷PBS的滅菌燒杯中；將大于9 mm的卵泡分離到含有預(yù)冷PBS的玻璃皿中,剝離卵泡外膜、結(jié)締組織及血管網(wǎng),在卵泡上剪開一個(gè)1 cm左右的小口,將大部分卵黃倒出,用眼科鑷從開口處將卵泡外翻,可見一層透明膜,即為顆粒層；PBS沖洗分離的顆粒層,盡量將卵黃漂洗干凈,轉(zhuǎn)移至安瓿瓶中；將顆粒層剪碎至1 mm3以下,加入適量Ⅱ型膠原酶,放入37℃培養(yǎng)箱中消化5 min,每隔1 min晃動(dòng)安瓿瓶使消化均勻,消化完畢后加入與等體積預(yù)冷M199培養(yǎng)基終止消化；200目濾網(wǎng)過濾至10 mL EP管中,1 000 r/min離心8 min,棄上清,加入M199培養(yǎng)基重懸,再次離心,重復(fù)兩次,以除去殘余酶液及雜質(zhì)；臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)活細(xì)胞數(shù),按8×105個(gè)/mL接種于6孔板內(nèi),24 h后觀察細(xì)胞生長狀況。

1.6 雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng) 蛋雞選取參考1.5,在無菌的條件下,取8～10枚小黃卵泡,PBS清洗干凈,除去周圍結(jié)締組織；用剪刀將小黃卵泡剪開一個(gè)小口,輕輕按壓卵泡,釋放卵黃,PBS清洗兩次,盡可能地去除卵黃顆粒；將清洗后的卵泡轉(zhuǎn)移至安瓿瓶中,剪成1 mm3左右大小的組織塊；加入適量的12.5 μg/mLⅡ型膠原酶,37℃消化8～10 min,之后加入等量的M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化；200目濾網(wǎng)過濾,1 000 r/min離心8 min,棄上清；M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸顆粒細(xì)胞,1 000 r/min離心8 min,棄上清,基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗兩次,除去殘存的膠原酶；使用M199完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù),細(xì)胞存活率在90%以上,按5×105個(gè)/mL接種于用鼠尾膠原預(yù)鋪的6孔板內(nèi),24 h后觀察細(xì)胞生長狀況。

1.7 顆粒細(xì)胞的鑒定

1.7.1 H.E.染色 取生長旺盛第5天的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞、第3天的雞等級卵泡顆粒細(xì)胞使用0.25%含EDTA的胰酶在37℃培養(yǎng)箱中消化30 s,棄去胰酶,使用培養(yǎng)基終止消化并重懸細(xì)胞,接種于細(xì)胞爬片上,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后PBS清洗3 min×3次；4%多聚甲醛4℃固定20 min,PBS清洗3 min×3次；H.E.染色：蘇木精染色2 min,1%鹽酸分化30 s,氨水返藍(lán)2 min；梯度酒精脫水：70%乙醇2 min→80%乙醇2 min→90%乙醇2 min→95%Ⅰ乙醇4 min→95%Ⅱ乙醇4 min→100%Ⅰ乙醇5 min→100%Ⅱ乙醇5 min→二甲苯Ⅰ10 min→二甲苯Ⅱ10 min；中性樹脂封片,顯微鏡下觀察。

1.7.2 FSHR的表達(dá)鑒定 將胰酶消化后的細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上,培養(yǎng)48 h后取出爬片,PBS洗滌3 min×3次；冰無水乙醇4℃固定20 min,PBS清洗3 min×3次；0.2%Triton×-100細(xì)胞通透液,在室溫條件下?lián)u床上孵育通透15 min,PBS清洗3 min×3次；3%正常山羊血清37℃封閉30 min,PBS清洗3 min×3次；加入100 μL FSHR兔多克隆抗體(1∶50),37℃孵育2 h,PBS清洗5 min×3次；加入100 μL FITC標(biāo)記的鼠抗兔抗體(1∶100),37℃孵育1 h,PBS清洗5 min×3次；使用抗熒光衰減封片劑(DAPI)封片,激光共聚焦拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同種屬卵巢顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)方法比較及優(yōu)化

表1 雞、小鼠卵巢顆粒細(xì)胞提取方法比較

由表1可知,小鼠與雞不同等級卵巢顆粒細(xì)胞的提取方法不同,且操作過程中需要的培養(yǎng)基及操作液也不相同。采用合適的方法提取不同種屬卵巢顆粒細(xì)胞對于體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞尤其重要。

同時(shí)在試驗(yàn)過程中對提取步驟進(jìn)行優(yōu)化,將取出的小鼠卵巢放置于含有胎牛血清的操作液中進(jìn)行刺破以釋放顆粒細(xì)胞,與在只含有PBS的操作液中刺破卵泡相比,24 h細(xì)胞貼壁增多,48 h生長良好,對比培養(yǎng)結(jié)果見圖1。培養(yǎng)雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞時(shí),將細(xì)胞分別接種于鼠尾膠原預(yù)鋪板和普通細(xì)胞培養(yǎng)板,普通板細(xì)胞24 h也均貼壁完全,但貼壁狀況與鼠尾膠原預(yù)鋪板相比,貼壁較差,細(xì)胞較少,圖2為培養(yǎng)48 h后細(xì)胞生長狀態(tài)對比結(jié)果。鼠尾膠原預(yù)鋪板細(xì)胞24 h時(shí)均已貼壁,生長狀況良好；24～48 h期間,細(xì)胞迅速增長,48 h時(shí),細(xì)胞鋪滿6孔板整個(gè)孔,見圖3。

2.2 不同種屬卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較 由圖3可知分離提取出的小鼠卵巢、雞等級卵泡、雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞在24 h觀察時(shí)均貼壁完全,且分離出的顆粒細(xì)胞所含雜質(zhì)較少,48 h后細(xì)胞舒展,快速生長。表2為小鼠卵巢顆粒細(xì)胞、雞等級卵泡顆粒細(xì)胞和雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞形態(tài)及生長特點(diǎn)的差異。可知不同種屬或相同種屬不同等級卵泡顆粒細(xì)胞生長狀態(tài)均存在差異。

圖1 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞不同操作液培養(yǎng)48 h細(xì)胞生長狀態(tài)

圖2 不同條件下雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞生長48 h狀態(tài)

圖3 不同種屬卵巢顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察

表2 雞、小鼠卵巢顆粒細(xì)胞生長特點(diǎn)

2.3 顆粒細(xì)胞的鑒定 H.E.染色結(jié)果顯示(見封二彩版圖4),小鼠卵巢顆粒細(xì)胞貼壁后形態(tài)完整,大小均一,呈多角形或者梭形,細(xì)胞核深染呈橢圓形,胞漿染為淡紅色。雞等級卵泡和小黃卵泡顆粒細(xì)胞H.E.染色結(jié)果顯示細(xì)胞形態(tài)完整,邊緣清晰,呈短梭形或多角形,細(xì)胞核藍(lán)色深染,胞漿淡染。

圖4 不同種屬卵巢顆粒細(xì)胞 (H.E.染色)

FSHR為卵巢顆粒細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白,定位于胞漿,見封二彩版圖5可知,綠色熒光均勻分布于胞漿中,細(xì)胞核染色清晰,結(jié)果顯示大于95%的細(xì)胞被染上綠色熒光,為陽性結(jié)果。因此可鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞均為卵巢顆粒細(xì)胞,且純度達(dá)到95%以上。小鼠與雞顆粒細(xì)胞的鑒定均以FSHR為標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 卵巢顆粒細(xì)胞FSHR蛋白的表達(dá)與定位

3 討論

卵巢顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)為研究卵泡閉鎖、生殖相關(guān)疾病提供了一個(gè)良好的體外研究體系。參照已有相關(guān)的文獻(xiàn),本實(shí)驗(yàn)采用機(jī)械法分離培養(yǎng)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞[9-10]。張春燕等人報(bào)道[11],超排效果隨著年齡的增長而下降,性未成熟時(shí)超排效果較好。試驗(yàn)選取3周齡性未成熟小鼠,卵巢上基本上是未充分發(fā)育的初級卵泡,此階段注射PMSG,大量原始卵泡開始同步發(fā)育,可以盡可能獲得多的生長發(fā)育相對一致顆粒細(xì)胞[12],確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。朱娜等人[13]報(bào)道,不同發(fā)情周期超排效果不同,在發(fā)情期、后期與間期進(jìn)行超排,均可出現(xiàn)數(shù)量不等的黃體,發(fā)情前期注射PMSG 48 h后,可見較多的有腔卵泡,卵泡體積較大,且突出于卵泡表面,少見黃體,發(fā)情前期是最適宜的小鼠超排時(shí)期。因此本試驗(yàn)選擇發(fā)情前期的3周齡性未成熟小鼠,超排后獲得的卵巢發(fā)育較好,卵泡較多,少見黃體等。有文獻(xiàn)報(bào)道[14-16],適宜的超排劑量與時(shí)間對于卵泡發(fā)育數(shù)量有很大的影響。因此在選擇超排劑量時(shí),應(yīng)注意根據(jù)參考文獻(xiàn)及實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)節(jié)超排劑量與時(shí)間,避免因超排而導(dǎo)致小鼠卵巢卵泡發(fā)育問題或質(zhì)量不佳等,從而導(dǎo)致提取出來的顆粒細(xì)胞量少,無法正常培養(yǎng)。體視顯微鏡下觀察超排狀態(tài)好的卵巢形態(tài)應(yīng)該為干凈、大量卵泡突出于卵巢皮質(zhì),較少或基本沒有黃體、紅體的存在。在刺破卵泡時(shí),將卵巢置于含有血清的培養(yǎng)基中,分離出的顆粒細(xì)胞優(yōu)于置于PBS中,可能原因是需要刺破的卵巢卵泡較多,其放置在操作液中的時(shí)間較長,如果直接選用PBS,細(xì)胞沒有一個(gè)適合的生存環(huán)境,將造成更大量細(xì)胞的死亡。根據(jù)上述方法分離,培養(yǎng)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞24 h后貼壁較多,48 h細(xì)胞舒展開,體積變大,4～5 d后鋪滿板底。

雞等級卵泡顆粒細(xì)胞的提取使用酶消化法[17-18]。在機(jī)械分離等級卵泡顆粒層時(shí)極易因?yàn)閷⒙腰S傾倒干凈,而丟失顆粒層,因此操作過程中注意卵黃倒出程度。提取出的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后完全貼壁,72 h鋪滿板底,生長狀態(tài)良好。雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞使用酶消化法提取,在已報(bào)道的文獻(xiàn)[19-20]基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。本試驗(yàn)對直接剝離顆粒層與未剝離比較。采用直接剝離顆粒層的方法時(shí),剝離出來的顆粒層易碎,無法完全收集,PBS清洗2～3次后,最終收集到的顆粒細(xì)胞較少。而只擠出卵泡中卵黃來提取顆粒細(xì)胞的方法,顆粒層并未脫離卵泡膜層,擠出卵黃后,直接夾取卵泡進(jìn)行清洗,此方法所收集到的顆粒細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)大于直接剝離顆粒層,且生長狀況由于直接剝離的方法,可能是由于直接剝離的方法導(dǎo)致取出的顆粒層特別碎,無法很好的收集。而顆粒細(xì)胞呈聚集生長,細(xì)胞數(shù)量較少,導(dǎo)致細(xì)胞生長狀態(tài)較差。同時(shí)需要注意在擠出卵黃時(shí),先使卵黃自行流出,再輕輕按壓卵泡即可,若力氣過大,會(huì)使卵黃連同顆粒層一起擠壓出來,不能充分分離提取顆粒細(xì)胞。

由于種屬的不同導(dǎo)致小鼠與雞的卵巢顆粒細(xì)胞提取方法不同,且小鼠卵巢顆粒細(xì)胞與雞卵泡顆粒細(xì)胞形態(tài)上與生長特性也存在一定差異。偽足能夠擴(kuò)大細(xì)胞表面積,主要功能是運(yùn)動(dòng)和幫助進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)交換,與細(xì)胞生長發(fā)育密切相關(guān)。雞卵泡顆粒細(xì)胞偽足較多,可能是雞為連續(xù)產(chǎn)蛋動(dòng)物,每隔25 h左右排卵一次,顆粒細(xì)胞活力旺盛,對于周圍營養(yǎng)物質(zhì)的攝取較多。而小鼠發(fā)情周期為4～5 d,排卵周期較長,因此相對雞卵泡顆粒細(xì)胞的偽足少。

FSHR是卵巢顆粒細(xì)胞特異性表達(dá)的受體[21],通過細(xì)胞間接免疫熒光的方法,可以鑒定出細(xì)胞的特異性并對其純對進(jìn)行檢測。試驗(yàn)結(jié)果表明,根據(jù)上述分離、提取顆粒細(xì)胞的方法,可以有效提出顆粒細(xì)胞,且純度高于95%,符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

綜合分析小鼠卵巢顆粒細(xì)胞與雞不同等級卵泡顆粒細(xì)胞的分離方法,可知不同種屬因?yàn)閭€(gè)體差異、卵泡形態(tài)差異,所需的有效提取方法不一樣。同一種屬不同等級卵泡因?yàn)槁雅荽笮〉牟町?導(dǎo)致在分離顆粒層的操作上需有所改變。同時(shí)在提取過程中,需要注意不同提取方法的要點(diǎn),以便得到質(zhì)量更好的顆粒細(xì)胞。