牛源腔隙莫拉菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

朱利霞，王洪彬，趙希艷，王雙月，史秋梅，高光平

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066600)

莫拉菌屬的細(xì)菌是短鏈狀或成對(duì)狀的革蘭陰性菌、短且寬，接近球狀，一直被認(rèn)為具有潛在的致病性，多數(shù)寄居在人和溫和動(dòng)物的皮膚和黏膜中，如上呼吸道、口腔，是呼吸道繼發(fā)性感染致病菌之一[1]。文獻(xiàn)顯示，從豚鼠[2]、駱駝[3]、山羊[4-5]、犬[6]等多種動(dòng)物中分離到該菌。近年來(lái)，由該菌屬細(xì)菌引起的細(xì)菌性疾病呈逐年增加趨勢(shì)，部分分離株致病性較強(qiáng)，其中腔隙莫拉菌主要引起結(jié)膜炎、腦膜炎、肺炎、慢性鼻竇炎和心內(nèi)膜炎等病癥[7]；該菌引起人類患病的報(bào)道也在逐年增多[8-9]，但未見(jiàn)從病牛分離到腔隙莫拉菌的報(bào)道。本研究以河北省某牛場(chǎng)采集的病牛鼻腔拭子樣品中分離純化得到的病原菌為試驗(yàn)菌株，對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，為由腔隙莫拉菌引起的牛細(xì)菌性疾病的防控提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來(lái)源 患呼吸道病牛的鼻拭子，采集自河北省某養(yǎng)牛場(chǎng)；昆明系小鼠，體質(zhì)量 20±2g，雌雄各一半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；E.Z.N.A.TMPlasmid MiniKit 質(zhì) 粒提取試劑盒、Gel extraction kit 購(gòu)自 Omega 公司；DL 2000 DNA Marker、dNTP、ExTaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa 公司；常規(guī)藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；pMD18-T 載體、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；本研究用到的中藥購(gòu)自秦皇島民樂(lè)醫(yī)藥。

1.3 病原菌的分離純化 將無(wú)菌采集的病牛鼻拭子樣品接種于TSA平板(含 5 %胎牛血清)，置 37 ℃培養(yǎng)24 h；挑取優(yōu)勢(shì)菌株的單菌落再次劃線接種于TSA、SS、EMB、TCBS培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24 h；挑取單菌落經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察結(jié)果；無(wú)菌挑取優(yōu)勢(shì)菌株的單菌落，接種于新鮮的TSB 培養(yǎng)液(含5 %胎牛血清)中，于 37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng) 24 h，加入甘油凍存菌種。

1.4 病原菌的生化鑒定 挑取優(yōu)勢(shì)菌株單菌落制備菌懸液；利用ID32E 生化鑒定試紙條進(jìn)行細(xì)菌鑒定，由法國(guó)梅里埃公司提供的ATB 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)判定結(jié)果。

1.5 分離菌株的16S rDNA 鑒定 利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA；利用16S rDNA 通用引物對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；陽(yáng)性產(chǎn)物回收與 pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coli中，PCR 檢測(cè)陽(yáng)性的菌液由北京生工生物工程有限公司測(cè)序鑒定。

將測(cè)序所得的16S rDNA 基因序列與GenBank中登錄的相應(yīng)莫拉菌屬細(xì)菌進(jìn)行比對(duì)分析，并利用DNAStar 軟件分析其同源性并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 分離菌株的致病性試驗(yàn) 將分離菌株單菌落接種于TSB 培養(yǎng)液(含 5 %胎牛血清)中，置37 ℃培養(yǎng)24 h，采用瓊脂平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌含量；以無(wú)菌的 PBS 分別將其 10 倍倍比稀釋(1.0×105cfu/mL～1.0×109cfu/mL)，每個(gè)濃度經(jīng)腹腔注射接種 5 只小鼠，0.2 mL/ 只，對(duì)照組 5 只小鼠注射無(wú)菌 PBS，0.2 mL/ 只[10]。

1.7 分離菌株的藥敏試驗(yàn)

1.7.1 西藥藥敏試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)推薦的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)并判定結(jié)果[11]。

1.7.2 中藥藥敏試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[12]的水煎煮法提取中藥有效成分，終濃度為1 g/mL；采用瓊脂平板打孔法進(jìn)行中藥藥敏試驗(yàn)，試驗(yàn)菌液濃度為1.0×107cfu/mL。在 TSA 平板(含 5%胎牛血清)均勻涂抹 100 μL分離菌菌液，然后用直徑6 mm 的打孔器打4 個(gè)孔，用無(wú)菌的0.5 %瓊脂封底，其中第 3 孔加入 100 μL中藥提取液，另1 孔加入無(wú)菌等量生理鹽水作陰性對(duì)照，重復(fù) 3 次，將其正面朝上置 37 ℃培養(yǎng) 24 h后觀察結(jié)果，測(cè)定抑菌圈直徑。以3 次抑菌圈直徑的平均值作為藥物對(duì)該菌的抑菌圈直徑。判定標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑≥20 mm 為極敏，15 mm≤抑菌圈直徑＜20 mm 為高敏，10 mm≤抑菌圈直徑 ＜15 mm 為中敏，抑菌圈直徑＜10 mm 為耐藥。采用試管二倍稀釋法[13]進(jìn)行中藥最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定。試驗(yàn)過(guò)程中，加入 TTC 有助于準(zhǔn)確判斷MIC 值，當(dāng)孔內(nèi)不顯示紅色時(shí)，即為該中藥的MIC。分別蘸取各試管中的液體，涂布于TSA 平板(含5 %胎牛血清)，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)的最低濃度即為該中藥的最低殺菌濃度(MBC)[14]。

2 結(jié) 果

2.1 分離菌株的形態(tài)特征 對(duì)患病牛的鼻拭子樣品進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果分離純化得到1 株優(yōu)勢(shì)菌株；分離菌株不能在 SS、EMB、TCBS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；在TSA 平板上長(zhǎng)出乳白色、邊緣整齊、凸起、不透明、濕潤(rùn)的菌落；在血平板上長(zhǎng)出灰白色、濕潤(rùn)、半透明、圓形、凸起、不溶血菌落；革蘭氏染色結(jié)果顯示，分離菌株為革蘭陰性短桿菌或球桿菌，菌體兩端鈍圓，無(wú)芽胞，單個(gè)或成對(duì)排列(圖1)，將其命名為Mor QHD-1。

圖1 分離菌株革蘭氏染色形態(tài)(100×)Fig.1 Micrograph of the isolate with Gram staining (100×)

2.2 分離菌株的生化鑒定 對(duì)分離菌株Mor QHD-1 進(jìn)行生化鑒定。結(jié)果顯示，Mor QHD-1 具有觸酶、氧化酶活性，無(wú)苯丙氨酸脫氫酶活性；硝酸鹽還原反應(yīng)和明膠液化反應(yīng)均為陽(yáng)性；不能發(fā)酵麥芽糖、甘露醇、木糖、蔗糖、乳糖、果糖、阿拉伯糖、鼠李糖；不能分解尿素及不能利用枸櫞酸鹽；V-P 試驗(yàn)陰性；不產(chǎn)生硫化氫等。參考 《 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行比對(duì)，分離菌株Mor QHD-1 符合腔隙莫拉菌(Moraxella lacarnata)的生理生化特性。

2.3 分離菌株的16S rDNA 鑒定 以分離菌株Mor QHD-1的基因組DNA為模板，進(jìn)行16S rDNA 的PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的片段在 1 500 bp 左右，與預(yù)期相符(圖2)，進(jìn)一步表明分離菌株為腔隙莫拉菌。

圖2 分離菌株Mor QHD-1 的16S rDNA 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.2 Amplification for 16S rDNA gene of Mor QHD-1 isolate by PCR

2.4 分離菌株的同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立將測(cè)序得到的16S rDNA 基因序列經(jīng)Blast 比對(duì)分析，結(jié)果顯示分離菌株 Mor QHD-1 的 16S rDNA 基因序列與GenBank 中腔隙莫拉菌相應(yīng)基因序列同源性為97.6 %。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示分離菌株Mor QHD-1與液化莫拉菌(Moraxella nonliquefaciens)、犬莫拉菌(Moraxella canis)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、林肯莫拉菌(Moraxella lincolnii)、苯丙酮酸莫拉菌(Moraxella phenylpyruvica)、亞特蘭大莫拉菌(Moraxella atlantae)、奧斯陸莫拉菌(Moraxella osloensis)等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與腔隙莫拉菌自然聚為一簇(圖3)，進(jìn)一步表明了分離菌株 Mor QHD-1 為腔隙莫拉菌。

2.5 分離菌株致病性試驗(yàn) 將分離菌株Mor QHD-1 采用不同的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行致病性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，小鼠在感染約12 h 開(kāi)始出現(xiàn)精神不振，部分小鼠食欲降低，甚至廢絕；小鼠在感染24 h 后，高劑量組小鼠出現(xiàn)不同程度的死亡，而低劑量組小鼠未出現(xiàn)死亡。將死亡的小鼠剖檢，發(fā)現(xiàn)小鼠心包有少量積液，肺臟、肝臟有出血點(diǎn)等。無(wú)菌取死亡小鼠心包積液、肺臟、肝臟樣品接種于TSA 平板進(jìn)行細(xì)菌分離純化。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定、16S rDNA 鑒定，確定為腔隙莫拉菌，與本實(shí)驗(yàn)接種菌株一致。表明分離菌株Mor QHD-1 具有一定的致病性。

圖3 分離菌株與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences between Mor QHD-1 isolate and the related strains

2.6 分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 西藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，因此可以選用氨基糖苷類、氟喹諾酮類和β- 內(nèi)酰胺酶類藥物治療由腔隙莫拉菌引起的牛細(xì)菌性疾病。

表1 分離菌株西藥敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Drug susceptibility test of the isolate

2.6.2 中藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果 選用動(dòng)物養(yǎng)殖中常用中藥進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，分離菌株 Mor QHD-1 對(duì)蘇木、訶子、烏梅、黃柏、五味子、黃連、五倍子極敏；對(duì)知母、厚樸等中藥耐藥(表2)。蘇木、黃柏、五倍子、黃連對(duì)腔隙莫拉菌的MIC 和MBC 較小，均在 1.95 mg/mL～7.82 mg/mL，其次為訶子、烏梅、五味子的 MIC 和 MBC 在 15.63 mg/mL～62.50 mg/mL。表明分離菌株 Mor QHD-1 對(duì)不同中藥敏感性不同。

表2 分離菌株中藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Chinese herbal medicine susceptibility test of the isolate

3 討 論

腔隙莫拉菌是一種條件性致病菌，也是人畜共患菌之一，其可以導(dǎo)致結(jié)膜炎、兒童中耳炎、慢性鼻竇炎及咽炎。由該菌引起的侵入性感染比較少見(jiàn)，國(guó)外曾有報(bào)道該菌引起人敗血癥[1,15]、化膿性關(guān)節(jié)炎[16]和感染性心內(nèi)膜炎[17]等，國(guó)內(nèi)由該菌引起的病例也較為少見(jiàn)。謝林峰等在患病嬰兒血液中分離到腔隙莫拉菌[18]；沈伊娜等報(bào)道腔隙莫拉菌可以引起人類敗血癥[19]；趙莉萍等從腦脊液中分離到1 株腔隙莫拉菌[20]；白麗等報(bào)道該菌致一位腎衰女性患者尿路感染[21]；楊海蓮等首次在茶飲料中檢測(cè)出腔隙莫拉菌并導(dǎo)致人發(fā)病[22]；梁莎莎報(bào)道腔隙莫拉菌可以引起男泌尿、生殖道感染[9]，因此具有公共衛(wèi)生學(xué)意義。近年來(lái)由腔隙莫拉菌引起人類發(fā)病的病例報(bào)道逐年增多[9,23]，已經(jīng)引起醫(yī)護(hù)人員和科研工作者的重視。本實(shí)驗(yàn)從患有呼吸道疾病的牛鼻腔拭子中分離到1 株優(yōu)勢(shì)菌株，通過(guò)常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和分子生物學(xué)的方法鑒定，結(jié)果顯示分離菌株Mor QHD-1 與腔隙莫拉菌同源性高達(dá)97.6%，與腔隙莫拉菌屬于同一進(jìn)化分支。致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該分離菌株對(duì)小鼠具有一定的致病性，因此在獸醫(yī)臨床上不可忽視該菌對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的潛在威脅。

有效、合理使用藥物是防治細(xì)菌性疾病的重要措施之一。西藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株Mor QHD-1 對(duì)受試的15 種常用的抗菌藥物大部分均敏感，這可能也是該菌引起的相關(guān)疾病偶有發(fā)生，未出現(xiàn)大面積流行的重要原因。此外，中藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株 Mor QHD-1 對(duì)蘇木、訶子、烏梅、黃柏、五味子、黃連、五倍子極敏；對(duì)其余中藥的敏感性不同。因此，治療由該菌引起的疾病，需結(jié)合動(dòng)物本身的實(shí)際情況，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理用藥。

本實(shí)驗(yàn)分離的牛源腔隙莫拉菌為國(guó)內(nèi)首次分離，且具有一定的致病性；此外，董文龍等研究證實(shí)腔隙莫拉菌能夠跨物種傳播，使山羊和人類感染發(fā)病[5]，這給畜牧業(yè)的安全生產(chǎn)及人類的健康帶來(lái)一定的風(fēng)險(xiǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)該菌的研究相對(duì)較少，因此對(duì)其流行趨勢(shì)還需要更進(jìn)一步的研究。