氮添加對油松細(xì)根分解過程中酶活性的影響

孟 敏， 景 航， 姚 旭， 王國梁,2?， 劉國彬,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所，712100，陜西楊凌； 2.中國科學(xué)院 水利部 水土保持研究所，712100，陜西楊凌)

植物每年投入凈初級生產(chǎn)力的22%～67%到根系當(dāng)中，細(xì)根分解將會使大量的物質(zhì)能量從植物體轉(zhuǎn)入到土壤當(dāng)中[1]。相關(guān)研究表明，細(xì)根分解產(chǎn)生的物質(zhì)能量可能大于地上凋落葉[2- 3]。近年來，細(xì)根分解研究已成為全球C、N等養(yǎng)分循環(huán)，尤其全球C平衡的核心環(huán)節(jié)[4]。關(guān)于細(xì)根分解目前的研究主要有以下幾方面：首先隨著時間增加，細(xì)根分解速率不斷發(fā)生變化，總體表現(xiàn)為前期快而后期慢的趨勢[5- 7]；其次，不同粗細(xì)的根系分解速率有所差異，以前的研究發(fā)現(xiàn)較細(xì)的根系分解快于較粗的根系[8-10]，但是越來越多的研究指出較粗的根系分解速率也可能快于較細(xì)的根系[5,11]，結(jié)果主要取決于具體的植被和生態(tài)系統(tǒng)類型；最后，環(huán)境變化對細(xì)根分解產(chǎn)生不同的影響，Song Xinzhang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)3 g/(m2·a)水平N添加加速了竹林細(xì)根分解，而≥6 g/(m2·a)水平N添加會降低竹林細(xì)根分解速率，結(jié)果取決于N添加量和本地區(qū)的N含量背景值。在影響細(xì)根分解的環(huán)境因素中，土壤有效N的影響日益引起生態(tài)學(xué)家的關(guān)注[13]。這是因?yàn)樵谌蚍秶鷥?nèi)大氣N沉降持續(xù)增加的情況下，土壤有效N可通過影響細(xì)根分解過程改變生態(tài)系統(tǒng)碳在土壤、植物和大氣等主要碳庫的分配格局，進(jìn)而影響全球生態(tài)系統(tǒng)的碳平衡和養(yǎng)分循環(huán)過程[12,14]。

從根本上來說，細(xì)根是在水分淋溶、土壤動物破碎以及微生物酶的作用下分解的，其中微生物的酶解作用最為直接也最為重要[15]。纖維二糖酶也稱β-葡萄糖苷酶，它能將大分子纖維素降解為小分子糖以便于微生物利用。堿性磷酸酶普遍存在于土壤當(dāng)中，它與土壤及植株體內(nèi)有機(jī)磷的分解和再利用有著密切的關(guān)系。纖維二糖酶和堿性磷酸酶是參與土壤植物殘?bào)w碳、磷等轉(zhuǎn)化的重要水解酶類[16]。另外，半乳糖苷酶在土壤中的含量也較高，它能降解植物體含半乳糖苷的胞壁多糖，釋放游離的半乳糖，從而被微生物吸收利用[17]；可見，酶在細(xì)根分解過程中扮演著不可替代的角色。一般情況下，影響分解酶活性的主要因素有溫度、細(xì)根水分以及細(xì)根質(zhì)量等[18]。目前研究的熱點(diǎn)中，徑級、時間以及環(huán)境變化等對細(xì)根分解的影響都有可能通過酶來產(chǎn)生作用，因此研究酶活性的變化特征可以揭示分解速率隨細(xì)根徑級、分解時間以及環(huán)境變化的潛在機(jī)制，為預(yù)測細(xì)根分解如何影響全球C、N等養(yǎng)分循環(huán)研究提供依據(jù)；但是，目前關(guān)于細(xì)根分解酶活性的研究還比較薄弱，相關(guān)研究集中在地上凋落物與農(nóng)地管理變化方面[17,19- 20]。關(guān)于不同徑級細(xì)根分解過程酶活性的特征以及對環(huán)境N添加的響應(yīng)情況還鮮有報(bào)道。通過闡明不同徑級細(xì)根分解酶活性對N添加的動態(tài)響應(yīng)過程，可以完善細(xì)根分解機(jī)制中的微生物作用部分，并為今后生態(tài)系統(tǒng)與全球氣候變化研究提供參考。

油松(Pinustabulaeformis)林下土壤養(yǎng)分相對貧瘠，土壤有效N質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低，是研究土壤有效N升高如何影響植物細(xì)根分解酶活性最理想的森林生態(tài)系統(tǒng)之一；因此，本研究以黃土高原油松為研究對象，通過動態(tài)監(jiān)測不同徑級油松細(xì)根分解酶活性變化，以及可能影響酶活性的主要因素，期望為細(xì)根分解機(jī)制研究提供參考，為N沉降變化影響碳循環(huán)研究提供依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

實(shí)驗(yàn)在延安市宜川縣鐵龍灣林場松峪溝流域(E 110°06′, N 35°39′)進(jìn)行。該地區(qū)具有典型大陸季風(fēng)型氣候，年平均降水量584.4 mm，年平均氣溫9.7 ℃，無霜期180 d。研究區(qū)海拔為1 000～1 200 m，坡度為20°～25°。油松是黃土高原森林區(qū)最大的人工林種之一，可用于研究N添加對細(xì)根分解的影響。實(shí)驗(yàn)區(qū)油松林于1963年種植，目前保存1 400～1 800 株/hm2，林齡為50年。該林分平均郁閉度0.7，林分蓄積量75.5 m3/hm2，葉面積指數(shù)6.34。2015年11月對樣地進(jìn)行了植被調(diào)查，測定表層0～10 cm土壤有機(jī)碳、全氮和全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測定結(jié)果見表1。喬木層、灌木層和草本層生物量分別為112.96、3.56和8.28 t/hm2。植物群落種群有20多種，多樣性指數(shù)為0.51(用Simpson法計(jì)算)。林下灌木主要有胡頹子(ElaeagnuspungensThunb)、黃刺玫(RosaxanthinaLindl)、繡線菊(Spiraeasalicifolia)、忍冬(LonicerajaponicaThunb)、莢迷(ViburnumdilatatumThunb)等，覆蓋度30%；草本植物主要為大披針苔草(CarexlanceolataBoott)，覆蓋度30%～50%。

表1 人工油松林樣地基本概況Tab.1 Basic characteristics ofPinus tabulaeformisplantation

注：不同小寫字母表示氮添加處理之間達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)；N0、N3、N6和N9表示氮添加水平分別為: 0、3、 6和9 g/(m2·a)。 Notes: Different lowercase letters indicate the significant difference at 0.05 level. N0, N3, N6, and N9 are 0, 3, 6, and 9 g/(m2·a) respectively. DBH: Diameter at breast height.

2 材料與方法

2.1 細(xì)根樣品收集

2014年3月，在1年生油松苗圃建立16塊細(xì)根收集實(shí)驗(yàn)田(3 m×3 m)。同時，在油松林中建立16塊細(xì)根分解實(shí)驗(yàn)林(10 m×10 m)。細(xì)根收集實(shí)驗(yàn)田與分解實(shí)驗(yàn)林具有相同的氣候條件。細(xì)根收集實(shí)驗(yàn)田和細(xì)根分解實(shí)驗(yàn)林均采用多水平的N添加處理：0、3、6和9 g/(m2·a)(分別稱為N0、N3、N6和N9處理)。細(xì)根收集實(shí)驗(yàn)田和細(xì)根分解實(shí)驗(yàn)林每個N添加處理有4個重復(fù)。自2014年以來，硝酸銨(NH4NO3)溶解于蒸餾水中(每個細(xì)根分解實(shí)驗(yàn)林10 L，每個細(xì)根收集實(shí)驗(yàn)田1 L)，并在每年4、6、8和10月中降雨前1天均勻噴灑于每個地塊(每次噴灑每年1/4的N添加量)。N添加2年后(2015年10月)，從16塊細(xì)根收集實(shí)驗(yàn)田表層80 cm土壤中收集3種直徑油松細(xì)根(0～0.5 mm，>0.5～1.0 mm和>1.0～2.0 mm)。將所有細(xì)根在自來水中快速洗滌，然后在去離子水中快速洗滌以除去黏附的土壤顆粒，之后將它們在55 ℃下烘干數(shù)天至恒質(zhì)量。將細(xì)根切成約3 cm長，保存用于分解實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)根分解實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用分解袋法研究細(xì)根分解酶活性和養(yǎng)分含量變化。分解袋(10 cm×10 cm)由0.1 mm網(wǎng)孔尼龍網(wǎng)制成。將收集的細(xì)根樣品(10.00 g)放入分解袋后縫合。2015年11月，在每個細(xì)根分解實(shí)驗(yàn)林布設(shè)相應(yīng)N添加處理的細(xì)根，每個細(xì)根徑級布設(shè)5個重復(fù)分解袋用于5次取樣。根據(jù)細(xì)根在土壤中的分布范圍和相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)，布設(shè)時在土壤中45°角開1個10 cm深的槽，將分解袋埋入?？偣裁總€N添加處理(3個細(xì)根徑級 × 5次取樣 × 4個重復(fù)樣地)布設(shè)60個分解袋，實(shí)驗(yàn)中總共240個分解袋。

分解袋布設(shè)完成2、4、6、8和10個月后，從每個樣地中隨機(jī)收集3個徑級細(xì)根分解袋樣品。將收集的分解袋迅速運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，用刷子清潔粘附土壤。隨后將樣品分2部分保存，其中一部分記錄質(zhì)量后-20 ℃保存用于酶活性測定，另一部分樣品在55 ℃下烘箱干燥數(shù)天至恒質(zhì)量，之后記錄其含水率和干質(zhì)量，然后研磨用于有機(jī)碳、全氮、全磷元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析。每次取樣時還需要用溫度計(jì)記錄分解袋周圍溫度。

2.3 測定項(xiàng)目與方法

細(xì)根分解酶活性(μmol/(g·h))測定參考土壤酶活性測定方法，主要有3種酶：纖維二糖酶、堿性磷酸酶和半乳糖苷酶。酶活性測定采用四甲基傘形酮與七甲基香豆素相關(guān)水合物分解熒光法測定[18]。將細(xì)根樣品徹底剪碎混勻，準(zhǔn)確稱取1 g加入相當(dāng)于土壤pH的0.05 nmol/L醋酸- 醋酸銨緩沖液125 mL，震蕩30 min，吸取懸濁液150 μL入黑色96孔板，同時加入50 μL底物(不同種類酶活性測定對應(yīng)的底物種類不同),每次實(shí)驗(yàn)做無基質(zhì)對照(150 μL懸濁液+50 μL緩沖液)、空白對照(200 μL緩沖液)。保持恒溫37 ℃培養(yǎng)并計(jì)時等待，經(jīng)過2 h后選擇儀器為多功能酶標(biāo)儀，將其設(shè)定波長為450 nm和365 nm，放入板后運(yùn)行并讀取其吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線選擇四甲基傘形酮制作，之后作為依據(jù)獲得酶的活性數(shù)據(jù)。

有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)測定采用重鉻酸鉀氧化法[21]；氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)測定采用凱氏定氮法[22]；磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)測定采用鉬銻抗比色法[23]。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同N添加處理之間酶活性差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。采用3因素方差分析(three-way ANOVA)對N添加、細(xì)根徑級以及分解時間對酶活性的影響進(jìn)行比較。酶活性與細(xì)根物理化學(xué)質(zhì)量指標(biāo)間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)根分解過程中酶活性變化

纖維二糖酶活性在0.055～0.433 μmol/(g·h)范圍內(nèi)，堿性磷酸酶活性在0.071～0.463 μmol/(g·h)范圍內(nèi)，半乳糖苷酶活性在0.046～0.463 μmol/(g·h)范圍內(nèi)(圖1)。細(xì)根分解前期120 d內(nèi)纖維二糖酶活性微弱增加，120～240 d逐漸減小，而240 d以后又有微弱增加。堿性磷酸酶和半乳糖苷酶活性隨細(xì)根分解時間增加先增加后減小，在分解180 d時酶活性最高。N添加對不同種類酶活性的影響有所差異。分解第60、120、240天N3顯著促進(jìn)了0～0.5 mm細(xì)根纖維二糖酶活性，分解第180和300天N3顯著促進(jìn)了>0.5～1.0 mm細(xì)根纖維二糖酶活性，分解第120和300天N9顯著促進(jìn)了>1.0～2.0 mm細(xì)根纖維二糖酶活性。整個分解周期內(nèi)N添加對0～0.5 mm細(xì)根堿性磷酸酶活性的影響不顯著，對>0.5～1.0 mm以及>1.0～2.0 mm細(xì)根堿性磷酸酶活性的影響在不同分解時間變化較大。分解第60和100天N添加抑制0～0.5 mm細(xì)根半乳糖苷酶活性，分解第60和300天N9抑制了>0.5～1.0 mm細(xì)根半乳糖苷酶活性，分解第60和180天N9抑制了>1.0～2.0 mm細(xì)根半乳糖苷酶活性。

數(shù)據(jù)點(diǎn)上方“*”表示不同N處理之間有顯著差異，N0(□)、N3(◇)、N6(△)和N9(○)分別表示N處理水平0、3、6和9 g/(m2·a)。Notes: The *above each sample dot indicates a significant difference between the N treatments. N0, N3, N6, N9 represent N addition level 0, 3, 6, and 9 g/(m2·a). The same below.圖1 不同施氮處理下油松不同徑級細(xì)根酶活性動態(tài)Fig.1 Dynamics of enzyme activity of different-diameter fine roots ofPinus tabulaeformisin different treatments

3.2 不同變異因素對細(xì)根分解酶活性的影響

表2總體反映N添加、分解時間和細(xì)根徑級對酶活性的影響?？梢钥闯?，N添加顯著改變了纖維二糖酶和半乳糖苷酶活性(P<0.05)，但對堿性磷酸酶活性沒有顯著影響。隨著細(xì)根分解時間增加，3種酶活性都有極顯著變化(P<0.01)。不同徑級細(xì)根分解過程中半乳糖苷酶活性有顯著差異，但堿性磷酸酶和纖維二糖酶活性差異不明顯。N添加和分解時間交互作用對3種酶活性影響顯著，時間與細(xì)根徑級交互作用對纖維二糖酶和半乳糖苷酶活性影響顯著，而N添加、分解時間以及細(xì)根徑級3個變異因素交互作用對半乳糖苷酶活性有極顯著影響。

3.3 細(xì)根物理化學(xué)性質(zhì)對酶活性的影響

細(xì)根分解過程中3種酶活性與C、N、P元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及N與P質(zhì)量比均有顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，其中與N與P質(zhì)量比極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，其余為顯著正相關(guān)(表3)。堿性磷酸酶和半乳糖苷酶活性與細(xì)根水分含量極顯著正相關(guān)，纖維二糖酶活性與溫度極顯著負(fù)相關(guān)。不同種類酶活性之間均有顯著正相關(guān)關(guān)系，其中堿性磷酸酶活性和半乳糖苷酶活性之間的相關(guān)性最強(qiáng)。

表2 不同徑級細(xì)根酶活性方差分析Tab.2 Variance analysis of enzyme activities at different fine root diameters

表3 細(xì)根物理化學(xué)性質(zhì)與酶活性相關(guān)分析Tab.3 Correlations between enzyme activity and fine root physiochemical property

注：數(shù)據(jù)上方“*”表示兩者之間有顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，“**”表示兩者之間有極顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。Notes: The “*” above the data indicates a significant correlation between the variables, and “**” indicates a very significant correlation between two variables.

4 討論

4.1 N添加對細(xì)根分解酶活性的影響

我們的研究中纖維二糖酶活性在0.055～0.433 μmol/(g·h)范圍內(nèi)，堿性磷酸酶活性在0.071～0.463 μmol/(g·h)范圍內(nèi)，半乳糖苷酶活性在0.046～0.463 μmol/(g·h)范圍內(nèi)，這些結(jié)果與前人的研究結(jié)果[24- 26]一致。隨著細(xì)根分解時間增加，不同種類酶活性變化趨勢有所差異。纖維二糖酶分解前期活性增加，中期逐漸減小，后期又微弱增加。堿性磷酸酶和半乳糖苷酶活性在整個分解周期內(nèi)先增加后減小，在中期時活性最高。相比而言，洪慧濱等[25]的研究從4月開始，米櫧和杉木細(xì)根分解纖維二糖酶活性前期迅速升高，而后迅速降低，最后趨于緩和，寧南山區(qū)草本植物莖葉分解過程中其周圍土壤堿性磷酸酶活性呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢[27]。另外，從3月開始對農(nóng)田土壤加入有機(jī)質(zhì)進(jìn)行分解，土壤半乳糖苷酶活性前期增加迅速，后期則趨于緩慢降低[28]。研究表明對于不同種類的酶，其活性在分解過程中變化趨勢差異較大。這主要是由于酶活性十分敏感容易受到環(huán)境因素變化的影響，如溫度、水分、凋落物質(zhì)量、土壤結(jié)構(gòu)以及酸堿度等，并且不同種類酶活性對環(huán)境變化的耐受能力也有所不同，導(dǎo)致在不同的研究中，酶活性隨分解過程的變化趨勢差異很大。我們的實(shí)驗(yàn)開始于11月，此時植物凋落物大量產(chǎn)生，秋季環(huán)境溫度、水分條件等明顯發(fā)生變化。細(xì)根分解實(shí)驗(yàn)從這一時期開始能夠較完整的模擬自然環(huán)境減少人為誤差，其分解酶活性動態(tài)過程更加接近真實(shí)情況；因此證實(shí)細(xì)根分解過程中不同種類酶活性變化趨勢差異較大，并且不同研究中分解酶活性變化趨勢會因?yàn)闇囟?、水分、凋落物質(zhì)量等環(huán)境因子而有所不同。

N添加對不同種類酶活性的影響有所差異。低N(N3)促進(jìn)0～0.5 mm和>0.5～1.0 mm細(xì)根纖維二糖酶活性，高N(N9)促進(jìn)>1.0～2.0 mm細(xì)根纖維二糖酶活性；N添加對0～0.5 mm細(xì)根堿性磷酸酶活性的影響不顯著，對>0.5～1.0 mm以及>1.0～2.0 mm細(xì)根堿性磷酸酶活性的影響在不同分解時間變化較大。N添加抑制0～0.5 mm細(xì)根半乳糖苷酶活性，高N添加(N9)抑制>0.5～1.0 mm和>1.0～2.0 mm細(xì)根半乳糖苷酶活性?？傮w表現(xiàn)為低N促進(jìn)較細(xì)細(xì)根纖維二糖酶活性，高N促進(jìn)較粗細(xì)根纖維二糖酶活性；N添加抑制較細(xì)細(xì)根半乳糖苷酶活性，高N抑制較粗細(xì)根半乳糖苷酶活性。多重比較分析的結(jié)果表明：N 添加顯著改變了纖維二糖酶和半乳糖苷酶活性(P<0.05)，但對堿性磷酸酶活性沒有顯著影響。并且存在N添加與分解時間之間的交互作用對酶活性的影響有所差異。同樣，對沼澤濕地小葉章凋落物的研究也發(fā)現(xiàn)N添加對分解酶活性的影響會因?yàn)槊阜N類以及時間而有所差異[29]。王暉等[30]通過總結(jié)近年來國內(nèi)外模擬N沉降影響凋落物分解酶活性的研究發(fā)現(xiàn)，由于酶種類、凋落物質(zhì)量等差異，N沉降增加對纖維素酶類、木質(zhì)素酶類以及蛋白水解酶類的影響差異較大，這與本研究的結(jié)果保持一致。不同的是，王暉等人的研究指出隨著N沉降增加，磷酸酶類活性總體會隨之增加，而本研究中N添加對堿性磷酸酶的活性影響不顯著。出現(xiàn)這種差異可能與N添加處理時間有關(guān)，模擬N沉降是一個長期過程，我們的N添加實(shí)驗(yàn)持續(xù)2 年(時間較短)，短期N添加對一些生態(tài)過程的影響還不夠明顯，比如土壤呼吸、微生物群落組成[31- 32]；但是隨著N添加時間的增加，土壤有效N質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高的效應(yīng)可能會逐漸明顯，我們的研究將持續(xù)關(guān)注。

4.2 細(xì)根物理化學(xué)性質(zhì)對酶活性的影響

不同種類酶活性之間均有顯著正相關(guān)關(guān)系，并且堿性磷酸酶活性和半乳糖苷酶活性之間相關(guān)性最強(qiáng)。此結(jié)果符合堿性磷酸酶活性和半乳糖苷酶活性隨分解時間有相似變化的規(guī)律，并證實(shí)參與細(xì)根分解的各種酶并不是單獨(dú)作用的，它們之間不僅顯示出專有性特點(diǎn)，同時也存在共性關(guān)系[29]。影響分解酶活性最常見的因素包括溫度、水分以及細(xì)根質(zhì)量等[30]。相關(guān)性分析表明：1)在N添加條件下，3種酶活性與細(xì)根分解過程中C、N、P質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及N與P質(zhì)量比顯著相關(guān)(P<0.05)，其中與N與P質(zhì)量比極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，其余為顯著正相關(guān)。這與前人的研究[17,33]一致，研究表明外界環(huán)境變化能夠通過影響細(xì)根質(zhì)量進(jìn)而改變其分解速率與酶活性[17,30]。2)本研究顯示N添加能夠通過提高主要養(yǎng)分含量(C、N、P等)促進(jìn)細(xì)根酶解過程。N與P質(zhì)量比與分解酶活性之間顯著負(fù)相關(guān)，可能是微生物在N添加環(huán)境里更需要P導(dǎo)致的。3)另外，酶活性與溫度、水分條件的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，堿性磷酸酶和半乳糖苷酶活性與細(xì)根水分含量極顯著正相關(guān)，纖維二糖酶活性與溫度極顯著負(fù)相關(guān)。這與相關(guān)研究一致[17,34]，溫度對細(xì)根分解酶活性具有不同程度的影響，這主要取決于酶本身的性質(zhì)。通過比較酶活性與溫度、水分以及細(xì)根質(zhì)量之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，不同種類酶活性與細(xì)根質(zhì)量之間的相關(guān)性較為統(tǒng)一，而與溫度和水分之間的相關(guān)性變異較大。也就是說在N添加條件下，細(xì)根質(zhì)量是影響各種分解酶活性的普遍因素，而溫度和水分的作用效果因酶種類不同而有所差異。

5 結(jié)論

1)細(xì)根分解過程中不同種類酶活性的變化趨勢有所差異。也就是說在細(xì)根分解不同階段中，參與分解的酶種類和活性可能不同。

2)N添加對酶活性的影響總體表現(xiàn)為：低N促進(jìn)較細(xì)細(xì)根纖維二糖酶活性，高N促進(jìn)較粗細(xì)根纖維二糖酶活性；N添加抑制較細(xì)細(xì)根半乳糖苷酶活性，高N抑制較粗細(xì)根半乳糖苷酶活性，但是N添加對堿性磷酸酶活性影響不顯著。N添加對酶活性的影響會由于酶種類、分解時期以及細(xì)根徑級而有所差異。

3)在N添加影響各種酶活性的過程中，細(xì)根質(zhì)量的作用較為一致，而溫度和水分的作用差異明顯。