劉 蕾，厙 曉，錢 楊，李婭琳，聶 蓉，饒 瑜*

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

隨著人們的健康意識日益增強(qiáng)，益生菌因其益生功效而獲得越來越多的關(guān)注。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織于2002年將益生菌定義為“一類達(dá)到足夠數(shù)量時可對宿主產(chǎn)生有利作用的活的微生物”。其中植物乳桿菌是應(yīng)用最為廣泛的益生菌之一。臨床研究表明，植物乳桿菌對胃腸道疾?。ㄈ鐟?yīng)激性結(jié)腸綜合征、炎性腸病、腹瀉等）及變應(yīng)性疾?。ㄈ缣貞?yīng)性皮炎等）等方面具有積極的治療效果[1-3]。然而，關(guān)于植物乳桿菌基因功能的解析尚顯不足，且多集中在異源表達(dá)相關(guān)蛋白再進(jìn)行分析。此外菌劑在應(yīng)用及制備過程中，受到不良環(huán)境的脅迫。因此，需要其能夠抵御脅迫環(huán)境從而保證活性，且能夠在保存和運(yùn)輸過程中保持穩(wěn)定。目前主要通過優(yōu)化益生菌劑的保護(hù)壁材、添加輔劑等工程手段來提升菌株的抗脅迫能力[4-5]。關(guān)于如何從菌株自身的生理特性及基因特征角度來增強(qiáng)其抗性能力尚處于起步階段。

tuf基因編碼熱不穩(wěn)定延伸因子（elongation factor thermo unstable，EF-Tu），在細(xì)菌中是豐度最高的蛋白之一，參與蛋白質(zhì)合成最關(guān)鍵的步驟。此外，EF-Tu還具有諸多其他功能，參與細(xì)菌其他生理行為[6-7]。研究表明，F(xiàn)rancisella novicida的EF-Tu可以促發(fā)巨噬細(xì)胞的炎癥細(xì)胞因子[8]，然而Leptospira spp.的EF-Tu可以與血纖維蛋白溶原酶及補(bǔ)體因子H結(jié)合，從而導(dǎo)致組織浸潤和補(bǔ)體失活[9]。在Vibrio parahaemolyticus中EF-Tu被認(rèn)為是新的毒力因子[10]，而在Staphylococcus aureus中EF-Tu因其細(xì)胞質(zhì)或表面定位而表現(xiàn)出多種功能，與菌體對宿主組織的定植、存留和侵襲有關(guān)[11]。Gallibacterium的EF-Tu可能參與其生物被膜形成，與致病性有關(guān)。在益生菌領(lǐng)域，相關(guān)研究較為匱乏[12]。其中Lactobacillus reuteri的EF-Tu可以與豬胃黏液素結(jié)合，從而促進(jìn)細(xì)菌黏附于黏膜表面[13]。然而，與諸如大腸桿菌、沙門氏菌、酵母菌等工程菌相比，益生菌的基因工程操作元件相對較少，技術(shù)平臺相對不成熟，這也限制了益生菌的同源基因工程操作分析及基因重組菌劑的開發(fā)。

在此背景下，本研究采用同源超表達(dá)及電轉(zhuǎn)化技術(shù)，構(gòu)建植物乳桿菌tuf基因超表達(dá)重組菌株，對重組菌株的生長情況、抗脅迫能力、黏附能力及生物被膜形成能力進(jìn)行分析，并檢測tuf基因超表達(dá)對其他基因的轉(zhuǎn)錄水平有何影響。本研究為進(jìn)一步研究乳桿菌基因功能，從基因改造角度開發(fā)更高效的菌劑提供新的思路和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與細(xì)胞

LR-1分離自四川發(fā)酵泡菜，經(jīng)16S rDNA測序鑒定為一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），命名為植物乳桿菌LR-1；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購于寶生物工程（大連）有限公司；HT-29細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

乳酸菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，包括蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，葡萄糖20 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，牛肉浸膏10 g/L，K2HPO42 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫80 1 mL/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L。

大腸桿菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，包括胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.4，121 ℃滅菌15 min后備用。

1.1.3 試劑

R010Q PrimeSTAR HS DNA Polymerase、RR001A Ex Taq、6011 pMD 18-T Vector Cloning Kit 寶生物工程（大連）有限公司；EL0021 T4 DNA連接酶、RNasefree DNase I、RNase抑制劑以及DMEM（Dulbecoo's Modified Eagle Medium） 美國Thermo Scientific公司；DP209普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DP107高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit和TRIpure 北京艾德萊生物科技有限公司；胰酶-0.02%EDTA消化液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS） 北京索萊寶科技有限公司。

20%甘氨酸貯液：20 g 甘氨酸，溶于100 mL去離子水，高壓滅菌，常溫避光保存；MRSS（MRS，0.3 mol/L蔗糖）：10.269 g蔗糖溶于100 mL MRS，滅菌待用；MRSSM（MRS，0.3 mol/L蔗糖，0.1 mol/L MgCl2）：10.269 g蔗糖和 2 g MgCl2溶于100 mL MRS，滅菌待用；Washing Buffer（0.3 mol/L蔗糖，0.1 mol/L MgCl2）：0.269 g蔗糖和2 g MgCl2溶于100 mL去離子水中，滅菌待用；30%聚乙二醇-1500（polyethylene glycol-1500，PEG-1500）：15 g PEG-1500水浴加熱溶化后，溶于50 mL去離子水中，采用0.22 μm無菌濾器除菌，4 ℃保存。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15低溫高速離心機(jī) 德國Satorious公司；AIRTECH-SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Tanon 1600全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)上海天能科技有限公司；KF960聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；MicroPulser電轉(zhuǎn)化儀/電穿孔儀 美國Bio-Rad公司；FQD-96A實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantification real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）檢測系統(tǒng) 杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 穿梭重組質(zhì)粒tuf-pMD18T的構(gòu)建

提取植物乳桿菌LR-1的基因組，以基因組為模板，擴(kuò)增菌株LR-1的tuf基因。擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收。將tuf基因膠回收產(chǎn)物與pMD18T載體進(jìn)行連接，連接體系（10 μL）如下：tuf基因膠回收產(chǎn)物4 μL，pMD18T 1 μL，Solution I 5 μL。連接溫度16 ℃，連接時間2 h。連接結(jié)束后將連接產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，后培養(yǎng)于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板中，37 ℃培養(yǎng)至肉眼可見單克隆菌落。挑取單克隆菌落，置于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，進(jìn)行菌液PCR鑒定并篩選陽性單克隆菌落。將篩選的陽性菌株接種至含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，采用高純度小提中量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒tuf-pMD18T。將提取的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 過表達(dá)重組質(zhì)粒tuf-pMG76e的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒tuf-pMD18T進(jìn)行XbaI/XhoI雙酶切，并對tuf基因片段進(jìn)行切膠回收。同時將質(zhì)粒pMG76e（由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳尚武教授及李平蘭教授友情饋贈）進(jìn)行XbaI/XhoI雙酶切，并對線性化的質(zhì)粒pMG76e片段進(jìn)行切膠回收。將二者進(jìn)行連接，連接體系（10 μL）為：tuf基因片段4 μL，質(zhì)粒pMG76e 1 μL，Solution I 5 μL。連接溫度16 ℃，連接時間2 h。連接結(jié)束后將連接產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化完成后將菌株均勻涂布于含有200 μg/mL紅霉素的LB固體平板中，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單克隆菌落進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR鑒定，使用引物為76e-F/R，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增步驟同上所示。之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，篩選陽性克隆。將陽性菌株接種至含有200 μg/mL紅霉素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。對檢測合格的質(zhì)粒進(jìn)行再次雙酶切鑒定，檢測合格后置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備

將500 μL 20%甘氨酸貯液加到9.5 mL MRSS中，即為L-ZS9感受態(tài)培養(yǎng)基。以1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量將植物乳桿菌LR-1接種至以上培養(yǎng)基中，待菌生長至OD600nm達(dá)到0.5。將培養(yǎng)好的菌液至于10 mL離心管中，6 000 r/min、4 ℃離心8 min，收集菌體；去上清液，加入2 mL Washing Buffer洗滌沉淀，6 000 r/min、4 ℃離心8 min，收集菌體；重復(fù)此步驟；去上清液，加入2 mL 30% PEG-1500重懸后，6 000 r/min、4 ℃離心10 min；去上清液，加入200 μL 30% PEG-1500重懸，每管40 μL，置于冰上待用。

1.3.4 tuf同源過表達(dá)重組菌株的構(gòu)建及鑒定

采用電轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的含有tuf基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入植物乳桿菌LR-1感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建EF-Tu同源過表達(dá)重組菌株。具體方法如下：將4 μL LR-1感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到2 mm電擊杯中，點(diǎn)擊檢測是否爆杯，如果正常，作為對照組；分別將空載體pMG76e質(zhì)粒和重組質(zhì)粒tuf-pMG76e DNA（2 μL）與40 μL感受態(tài)細(xì)胞的混合后置于冰上（加質(zhì)粒量不要超過總體積的1/20）轉(zhuǎn)移到2 mm電擊杯中，置于冰上5 min，并確定沒氣泡；設(shè)定點(diǎn)擊程序1.5 kV，25 μL，400 Ω；進(jìn)行點(diǎn)擊后，冰上靜置5 min；加入1 mL MRSSM復(fù)蘇培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，37 ℃培養(yǎng)2 h；將復(fù)蘇的菌液7 000 r/min、常溫離心2 min，去除850 μL上清液后，涂布于含3 μg/mL紅霉素的MRS平板，37 ℃培養(yǎng) 36～48 h。

之后通過pMG76e鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步鑒定。分別挑取轉(zhuǎn)化子單克隆于含有3 μg/mL紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)16～18 h后，吸取100 μL培養(yǎng)菌液，10 000 r/min離心2 min，去除上清液，加入100 μL無菌水重懸菌泥，離心去除上清液，重復(fù)該步驟一次，之后用20 μL無菌水重懸菌泥，此為PCR擴(kuò)增體系模板，置于-20 ℃?zhèn)溆?。后進(jìn)行PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測，空載體導(dǎo)入菌株為陰性對照，擴(kuò)增引物序列為76F：5’-TTCGGTCCTCGGGATATG-3’；76R：5’-CTGTCTTGGCCGCTTCAA-3’。

1.3.5 tuf基因轉(zhuǎn)錄水平測定

通過qRT-PCR對tuf過表達(dá)重組菌株的tuf基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定，以進(jìn)一步鑒定tuf過表達(dá)重組菌株的構(gòu)建是否成功。將植物乳桿菌LR-1野生株、空載體pMG76e導(dǎo)入菌株和tuf過表達(dá)重組菌株接種于MRS培養(yǎng)基中，至37 ℃靜置培養(yǎng)8 h。培養(yǎng)完成12 000×g離心收集菌體，液氮研磨，加TRIpure，置于-80 ℃凍存。參照北京艾德萊生物科技有限公司的TRIpure提取步驟提取總RNA。cDNA的合成參照該公司TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行，方法如下：總RNA 50 ng～5 μg，隨機(jī)引物1 μL，5×RT Reaction Mix 4 μL，TUREscript H-RTase 1 μL，之后用RNase free H2O定容至20 μL。25 ℃孵育10 min，之后42 ℃孵育30～50 min，65 ℃加熱15 min以失活TUREscript H-RTase。DNaseI處理合成的cDNA后，置于-80 ℃待用。以16S rRNA為內(nèi)參基因，采用Primer 3 Input（version 0.4.0）設(shè)計(jì)引物，用于進(jìn)行qRT-PCR。引物序列如下：tuf-F：5’-GACCGCTGCAATCACTAAGG-3’；tuf-R：5’-GAGCGGCACCAGTAATCATG-3’。

qRT-PCR體系（20 μL）：1 μL模板cDNA，10 μL 2×Sybgreen，上游引物和下游引物各1 μL（10 μmol/L），以及7 μL無RNase水。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40 個循環(huán)。采用Livak法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.6 生長曲線測定

將植物乳桿菌LR-1野生株、空載體pMG76e導(dǎo)入菌株和tuf過表達(dá)重組菌株以1%接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h，分別在3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36 h收集培養(yǎng)液，測定OD600nm，繪制生長曲線。

1.3.7 耐熱、耐酸、耐膽鹽能力檢測

分別將植物乳桿菌LR-1野生株、空載體pMG76e導(dǎo)入菌株和tuf過表達(dá)重組菌株進(jìn)行活化。將收集到的菌體置于80 ℃水浴鍋中，處理3 min，進(jìn)行耐熱實(shí)驗(yàn)。將收集到的菌體分別重懸于pH值為2.8的MRS培養(yǎng)基中，處理1 h，進(jìn)行耐酸實(shí)驗(yàn)。將收集到的菌體分別重懸于含膽鹽0.2 g/100 mL的MRS培養(yǎng)基中，處理0.5 h，進(jìn)行耐膽鹽實(shí)驗(yàn)。處理結(jié)束后通過平板活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)3個平行，且進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。分別確定以上菌株的耐熱、耐酸和耐膽鹽能力。存活率計(jì)算如式（1）所示：

1.3.8 黏附能力檢測

將植物乳桿菌LR-1野生株、空載體pMG76e導(dǎo)入菌株和tuf過表達(dá)重組菌株接種于MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，5 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS洗滌菌體，并重懸至終濃度1×108CFU/mL。

將HT-29細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其長滿單層后（每孔約含2.5×105個細(xì)胞），每孔接種100 μL上述收集的細(xì)菌懸液，輕微晃勻后置于37 ℃培養(yǎng)1.5 h，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌5 次，加100 μL的0.1%胰酶-0.02% EDTA室溫處理10 min，消化細(xì)胞，再加900 μL DMEM，并用巴氏吸管吹打，取100 μL混合液進(jìn)行10 倍稀釋，各稀釋度取100 μL接種于MRS平板，37 ℃培養(yǎng)，記錄菌落數(shù)，實(shí)驗(yàn)每組設(shè)3 個平行，且進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。黏附率計(jì)算如式（2）所示：

1.3.9 生物被膜量檢測

生物被膜形成能力檢測采用結(jié)晶紫染色法。將活化的植物乳桿菌LR-1野生株、空載體pMG76e導(dǎo)入菌株和tuf過表達(dá)重組菌株接種于MRS培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)液加至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結(jié)束后用PBS輕柔沖洗3 次，去除懸浮菌體，室溫晾干。每孔加0.1%結(jié)晶紫溶液，室溫染色30 min，無菌水輕柔沖洗至洗液無色為止，室溫晾干。加100 μL無水乙醇充分溶解結(jié)晶紫，檢測OD595nm值。

1.3.10 其他基因轉(zhuǎn)錄水平的測定

按照1.3.5節(jié)提取LR-1野生株、空載體pMG76e導(dǎo)入菌株和tuf過表達(dá)重組菌株的總RNA，通過qRT-PCR對相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定。根據(jù)前期研究選定與乳桿菌抗脅迫能力、黏附能力及生物被膜形成能力相關(guān)的目標(biāo)基因，分別為果糖-二磷酸醛縮酶編碼基因fba、甘油醛-3-磷酸脫氫酶編碼基因gap、磷酸甘油酸變位酶編碼基因pgm、核糖激酶編碼基因rib和S-核糖高半胱氨酸酶編碼基因luxS。

以16S rRNA為內(nèi)參基因，采用Primer 3 Input（version 0.4.0）設(shè)計(jì)引物，用于進(jìn)行qRT-PCR。引物名稱及序列如表1所示。1.4 數(shù)據(jù)分析

表 1 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)Table 1 Primers used for real-time PCR

所有測試重復(fù)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)3次，用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（ANOVA）及作圖，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源超表達(dá)重組菌株tuf基因轉(zhuǎn)錄水平分析

圖 1 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1的PCR及瓊脂糖凝膠電泳鑒定Fig. 1 Identification of recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1 by PCR and agarsose gel electrophoresis

如圖1所示，11號條帶理論全長231 bp，tuf基因全長1 188 bp，1～10號條帶理論全長1 419 bp，與Marker對比可見，實(shí)際條帶大小均位于合理位置。PCR鑒定結(jié)果初步表明，重組菌株tuf-pMG76e-LR-1構(gòu)建成功。

重組菌株tuf-pMG76e-LR-1的tuf基因轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果如圖2所示，空載體導(dǎo)入菌株pMG76e-LR-1與野生型菌株LR-1相比，tuf基因的轉(zhuǎn)錄水平無明顯差異，重組菌株tuf-pMG76e-LR-1的tuf基因轉(zhuǎn)錄水平平均上約調(diào)105 倍，表明菌株tuf-pMG76e-LR-1的tuf基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。

圖 2 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1的tuf基因轉(zhuǎn)錄水平Fig. 2 Transcription of tuf in recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1

2.2 tuf超表達(dá)對菌株生長的影響

圖 3 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1的生長曲線Fig. 3 Growth curve of recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1

由圖3可知，空載體導(dǎo)入菌株pMG76e-LR-1與野生型菌株LR-1的生長情況較為一致，表明空載體pMG76e的導(dǎo)入不影響菌株LR-1的生長。同時，重組菌株tuf-pMG76e-LR-1的生長曲線表明，其早期的生長情況稍慢于空載體導(dǎo)入菌株pMG76e-LR-1與野生型菌株LR-1，但最終的菌懸液濃度與其余兩者一致。結(jié)果表明，tuf基因超表達(dá)在早期對菌株LR-1的生長有輕微抑制，但不影響最終菌株LR-1的生長情況。

2.3 tuf超表達(dá)對菌株抗脅迫能力的影響

圖 4 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1的耐熱能力分析Fig. 4 Heat resistance of recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1

通過對菌株tuf-pMG76e-LR-1、pMG76e-LR-1和LR-1的耐熱能力進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示，與野生型LR-1菌株相比，經(jīng)熱處理后，重組菌株tuf-pMG76e-LR-1的存活率上調(diào)至約2.75 倍。該結(jié)果說明tuf基因的超表達(dá)可增強(qiáng)菌株LR-1的耐熱能力。此外，tuf基因超表達(dá)對菌株LR-1的耐酸能力和耐膽鹽能力沒有顯著影響（本文中未顯示該結(jié)果）。

乳酸菌在開發(fā)為發(fā)酵菌劑或益生菌劑的過程中常常要經(jīng)歷各種脅迫環(huán)境，如噴霧干燥法的高溫環(huán)境[14-15]。有研究表明tuf基因編碼的EF-Tu為耐熱延伸因子，對熱極其穩(wěn)定，80 ℃、5 min處理原活性僅丟失50%[16]。研究表明該蛋白參與哺乳動物細(xì)胞從轉(zhuǎn)錄到翻譯熱應(yīng)激的全部過程[17]。對tuf基因表達(dá)情況對菌株耐熱性能的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明tuf基因過表達(dá)會顯著增強(qiáng)植物乳桿菌LR-1的耐熱能力，與EF-Tu在其他菌株的相關(guān)研究結(jié)果一致。

2.4 tuf超表達(dá)對菌株黏附能力的影響

圖 5 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1的黏附能力分析Fig. 5 Adhesion ability of recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1

由圖5可知，菌株LR-1對HT-29細(xì)胞具有一定的黏附能力，且pMG76空載體的導(dǎo)入會對其黏附能力起抑制作用，而tuf-pMG76e重組質(zhì)粒的導(dǎo)入會增強(qiáng)菌株的黏附能力，使黏附率平均上調(diào)至約1.6 倍。結(jié)果表明，tuf基因的超表達(dá)可以增強(qiáng)菌株LR-1的黏附性能。

有研究表明EF-Tu是一個黏附相關(guān)因子，Paracoccidioides brasiliensis的延伸因子EF-Tu與其對宿主的黏附和侵襲相關(guān)[18]。最新的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白可作為Mycoplasma hyopneumoniae表面的黏附素，通過與纖粘蛋白結(jié)合從而發(fā)揮多種作用[19]。對于Helicobacter pylori來說，EF-Tu在致病機(jī)理中扮演者潛在黏附因子的重要角色[20]乳桿菌的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus的EF-Tu在菌株黏附時發(fā)揮重要作用，它還參與調(diào)控其對腸道病原菌的抑制作用[21]。Lactobacillus acidophilus ATCC 4356的EF-Tu也是一個黏附相關(guān)因子[22]。菌株L. plantarum 423的EF-Tu參與調(diào)控其對Caco-2細(xì)胞的黏附作用[23]。最新的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白可作為Mycoplasma hyopneumoniae表面的黏附素，通過與纖粘蛋白結(jié)合從而發(fā)揮多種作用[19]。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果一致，且通過構(gòu)建同源重組菌株并直接檢測其黏附能力，表明tuf基因的表達(dá)情況與植物乳桿菌LR-1的黏附性能呈正相關(guān)，且超表達(dá)重組菌株tuf-pMG76e-LR-1自身的黏附能力增強(qiáng)。這提示研究人員益生菌tuf基因超表達(dá)重組菌株可能具有更強(qiáng)的體內(nèi)黏附定植能力，對于其更好的益生功效具有重要價值，具體研究需要進(jìn)一步動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。此外，空載體pMG76e導(dǎo)入菌株的黏附能力較野生菌株LR-1有所下降，可能是由于感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)化過程對菌體細(xì)胞本身黏附性能造成影響，或者空載體在菌體中復(fù)制對菌體細(xì)胞黏附性能產(chǎn)生干擾，具體原因尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

2.5 tuf超表達(dá)對菌株生物被膜形成能力的影響

圖 6 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1的生物被膜形成能力分析Fig. 6 Biofilm formation of recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1

如圖6所示，菌株LR-1具有較強(qiáng)的被膜形成能力，與野生型菌株的被膜形成量相比，空載體導(dǎo)入菌株pMG76e-LR-1無顯著差異，而重組菌株tuf-pMG76e-LR-1的被膜形成量增多，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上具有極顯著差異。結(jié)合2.2節(jié)研究結(jié)果，表明菌株培養(yǎng)36 h后，在tuf基因超表達(dá)不會影響菌株最終生長量的情況下，會顯著增強(qiáng)菌株LR-1的生物被膜形成能力。

益生菌的生物被膜研究處于起步階段，前期研究曾對類植物乳桿菌L-ZS9的生物被膜態(tài)生理行為進(jìn)行過分析，發(fā)現(xiàn)被膜態(tài)的菌體具有更強(qiáng)的抗脅迫能力及黏附能力[24-25]，因此選擇被膜形成作為一個重要檢測指標(biāo)。目前關(guān)于稱延伸因子EF-Tu調(diào)控生物被膜的形成的研究較為少見，Gallibacterium的EF-Tu具有淀粉樣性質(zhì)，存在于生物被膜中[12]。前期研究曾發(fā)現(xiàn)類植物乳桿菌L-ZS9的EF-Tu與菌株的生物被膜形成有關(guān)[26]。本研究與之前研究結(jié)果一致，植物乳桿菌LR-1的tuf基因表達(dá)量增高，可以增強(qiáng)菌株的被膜形成能力。其具體作用機(jī)制尚不明確，結(jié)合2.5節(jié)研究結(jié)果進(jìn)行分析，這可能是由于EF-Tu與黏附能力有關(guān)，且EF-Tu有可能是乳桿菌的一種黏附因子，其表達(dá)量增高可以增強(qiáng)菌株的固附著能力。

2.6 EF-Tu超表達(dá)對菌株其他基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

基于前期研究結(jié)果[24-26]，本研究選擇與乳桿菌抗脅迫能力、黏附能力及生物被膜形成能力相關(guān)的基因fba、pgm、gap、rib和luxS作為檢測基因，以空載體導(dǎo)入菌株pMG76e-LR-1為對照菌株，對重組菌株tuf-pMG76e-LR-1以上基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測。如圖7所示，重組菌株tuf-pMG76e-LR-1的基因fba、pgm、gap、rib和luxS轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)表達(dá)，其中l(wèi)uxS基因上調(diào)表達(dá)約47 倍，gap基因上調(diào)表達(dá)約48 倍，fba基因上調(diào)表達(dá)約56 倍，pgm基因上調(diào)表達(dá)約80 倍，rib基因上調(diào)表達(dá)約305 倍，上調(diào)倍數(shù)最為顯著。

圖 7 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1和pMG76e-LR-1的基因轉(zhuǎn)錄水平比較Fig. 7 Comparison of genes transcription of recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1 and pMG76e-LR-1

糖酵解途徑作為大多數(shù)生物所共有的基本代謝途徑，在有氧和無氧條件下均能進(jìn)行，且是糖代謝和脂類代謝的連接點(diǎn)，因此該代謝途徑的改變對微生物生理行為具有重要影響。本研究中pgm基因編碼磷酸甘油酸變位酶，fba基因編碼果糖-二磷酸醛縮酶，gap基因編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶，以上3 個基因參與微生物的糖酵解途徑。前期結(jié)果表明乳桿菌中的pgm、fba和gap基因表達(dá)情況與生物被膜形成呈正相關(guān)[26]。也有研究發(fā)現(xiàn)菌株Saccharomyces cerevisiae的糖酵解代謝途徑會影響其生物被膜形成[27]，菌株Listeria monocytogenes的被膜狀態(tài)中糖酵解途徑相關(guān)蛋白發(fā)生上調(diào)[28]，此外，生物被膜形成能力與黏附能力密切相關(guān)[29-30]。結(jié)合本研究結(jié)果可推測，tuf基因的超表達(dá)會誘導(dǎo)三者表達(dá)量的上調(diào)，說明tuf基因可能通過代表菌株LR-1的糖酵解效率來調(diào)控生理行為。

luxS基因編碼S-核糖高半胱氨酸酶，是細(xì)菌II型群體感應(yīng)系統(tǒng)信號分子的關(guān)鍵合成基因，該基因表達(dá)情況的改變常會影響細(xì)菌諸多生理行為的變化[31-33]。關(guān)于乳桿菌luxS的相關(guān)研究相較病原菌尚顯不足。目前研究表明L. plantarum KLDS1.0391中l(wèi)uxS與菌株脅迫耐受和黏附能力有關(guān)[31]。信號分子AI-2對L. acidophilus黏附能力也有重要影響[34]。LuxS代謝對于Lactobacillus rhamnosus GG的胃腸道耐受能力非常關(guān)鍵[35]。luxS基因的缺失會影響Lactobacillus reuteri 100-23的一些其他生理行為[36]。Lactobacillus spp.的酸應(yīng)激會誘發(fā)AI-2信號通路[37]。以上研究均表明luxS基因參與乳桿菌的抗脅迫、黏附以及其他生理行為。此外，Lactobacillus paraplantarum L-ZS9的luxS基因超表達(dá)對會顯著增強(qiáng)菌株的生物被膜形成能力[26]?；谝陨涎芯?，本研究結(jié)果表明菌株LR-1的tuf超表達(dá)菌株相關(guān)生理行為的改變可能是通過luxS表達(dá)水平上調(diào)來調(diào)控的。rib基因編碼核糖激酶，核糖激酶參與核糖代謝，與物質(zhì)循環(huán)及遺傳信息的合成有關(guān)，也是菌株初級代謝的重要調(diào)控基因。此外，前期研究也發(fā)現(xiàn)rib基因與菌株的生物被膜形成有關(guān)[26]。因此，選擇以上5 個基因作為檢測對象，發(fā)現(xiàn)tuf基因的上調(diào)會顯著增強(qiáng)以上5 個基因的表達(dá)，以上研究與本研究2.4、2.5節(jié)研究結(jié)果結(jié)合分析，表明tuf基因有可能通過上調(diào)以上基因來增強(qiáng)菌株LR-1的抗脅迫能力、被膜形成能力及黏附能力。

3 結(jié) 論

本研究通過電轉(zhuǎn)化構(gòu)建植物乳桿菌LR-1的tuf基因同源超表達(dá)重組菌株，并對其生長能力、抗脅迫能力、黏附能力及被膜形成能力進(jìn)行分析，結(jié)果表明tuf基因超表達(dá)對菌株LR-1的生長情況無非常的顯著影響，但是可以增強(qiáng)其耐熱性能、黏附能力及生物被膜形成能力。進(jìn)一步通過qRT-PCR對糖酵解途徑參與基因、II型群感關(guān)鍵基因及核糖激酶編碼基因fba、pgm、gap、luxS和rib的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)tuf基因超表達(dá)可誘導(dǎo)以上基因上調(diào)表達(dá)，為tuf基因超表達(dá)調(diào)控植物乳桿菌LR-1生理行為的分子機(jī)制提供參考。本研究為乳桿菌的基因功能分析及挖掘具有價值，同時為基因工程菌株在發(fā)酵菌劑或益生菌劑的開發(fā)應(yīng)用提供了理論支持。