鄧婷婷，黃文勝，葛毅強*，陳 穎,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；3.科技部中國農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心，北京 100045）

隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的日益擴大和著轉(zhuǎn)基因食品飛速發(fā)展，許多國家都出臺轉(zhuǎn)基因標識標簽制度，歐盟、韓國及日本的轉(zhuǎn)基因標識閾值（質(zhì)量分數(shù)）分別為0.9%、3.0%、5.0%[1-3]，我國自2002年起實施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》[4]，明確規(guī)定在中國境內(nèi)銷售農(nóng)業(yè)部許可并列入標識的轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品，必須進行轉(zhuǎn)基因成分的標識。隨著全世界標識制度的完善和定量標識制度的發(fā)展，建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測技術(shù)尤其是精準定量檢測技術(shù)將越來越重要。

目前國內(nèi)外針對轉(zhuǎn)基因成分定量分析最常用的方法是實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法，該技術(shù)依靠不同濃度的標準樣品建立標準曲線對未知模板進行定量分析，已比較成熟地用于轉(zhuǎn)基因定值當中[5-8]。我國也發(fā)布了多項基于實時熒光PCR技術(shù)的轉(zhuǎn)基因作物定量檢測標準方法[9-10]，其定量靈敏度在0.5%～0.1%之間。但是，實時熒光PCR技術(shù)用作定量時由于每次進行檢測操作都需同時進行已知濃度標準品的擴增并制作標準曲線，校準品和樣品間背景的不同及PCR擴增效率等因素都引入了偏差，導致其定量結(jié)果往往與實際值相差甚遠[11-12]。此外，低拷貝數(shù)的目標DNA分子很難通過擴增檢測到[13-15]，因此在實際應用中局限性較多。

數(shù)字PCR是近年來發(fā)展起來的單分子DNA絕對定量檢測技術(shù)，通過對樣品DNA極度稀釋，對每個微反應單獨進行PCR擴增后采用終點法檢測PCR產(chǎn)物，并依據(jù)泊松分布原理對靶基因定量，在不需要標準樣品的情況下實現(xiàn)目標成分的絕對定量[16]，有效避免了上述實時熒光PCR定量帶來的擴增反應抑制物、PCR擴增效率差異及標準曲線等帶來的定量偏差等問題，并可減少實時熒光PCR帶來的基體效應[17]。數(shù)字PCR具有測量獨立性與無需任何校準物的特點，也使得低豐度靶標分子的精準檢測成為可能[13,18-19]。由于數(shù)字PCR定量更加準確靈敏，目前已經(jīng)逐漸應用到轉(zhuǎn)基因定量分析和低含量的轉(zhuǎn)基因成分檢測中。Fu Wei等[20]選取CaMV35s啟動子和NOS終止子作為篩選轉(zhuǎn)基因作物的通用元件，用數(shù)字PCR進行定量檢測，并對MON810等9 種轉(zhuǎn)基因品系進行特異性驗證，結(jié)果獲得檢測限為0.1%這一低于歐盟規(guī)定閾值的結(jié)果，表明該方法特異性好、靈敏度高，適于轉(zhuǎn)基因成分含量的精確定量。David等[21]利用微滴式數(shù)字PCR方法分別建立了兩個多重定量方法，可對12 個品系的轉(zhuǎn)基因玉米進行含量測定，其檢出限、重復性和真實性均符合國際標準中GMO定量要求。其他研究也表明與實時熒光PCR方法相比，數(shù)字PCR定量方法定量更加準確靈敏[22-24]。

本研究基于微滴式和芯片式數(shù)字PCR平臺，以抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻為研究對象，擬建立轉(zhuǎn)基因水稻的精準定量分析方法，并與傳統(tǒng)的實時熒光定量PCR結(jié)果進行比較，以期為食品和農(nóng)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的定量分析提供新的方法和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉(zhuǎn)基因水稻（Oryza sativa）LL62品系（大米樣品）、轉(zhuǎn)基因大豆（Glycine max）GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因玉米（Zea mays）Bt11等標準物質(zhì)購于歐盟聯(lián)合研究中心標準物質(zhì)與測量研究所及美國油脂化學家協(xié)會。各種含量的轉(zhuǎn)基因克螟稻、TT51-1、KF6等轉(zhuǎn)基因大米標準樣品及非轉(zhuǎn)基因大米（明恢63）、大豆、玉米、小麥，高粱，油菜等樣品由本實驗室保存。

ddPCR Super Mix（no dUTP）、ddPCR Droplet Generation Oil、ddPCR Droplet Reader Oil、Droplet Generator DG8 Cartridge 美國Bio-Rad公司；RealMaster Mix（with ROX） 美國ABI公司；食品基因組提取試劑盒NucleoSpin?Food 美國MN公司。

1.2 儀器與設備

QX200?微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)（包括微滴生成器、封膜機、PCR擴增儀和微滴讀取儀） 美國Bio-Rad公司；Bio-Mark?微流體芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)（含儀器配套耗材） 美國Fluidigm公司；QuantStudio? 3D微流體芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)（含儀器配套耗材） 美國Life Technologies公司；7500實時熒光PCR儀 美國ABI公司；樣品研磨機 德國IKA公司；離心機 美國Beckman Coulter公司；Qubit核酸蛋白分析儀 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取

所有樣品材料放入樣品研磨機中，研磨至粒度60 目左右，樣品基因組DNA按照NucleoSpin?Food核酸提取試劑盒說明書提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物和探針的設計及合成

本實驗根據(jù)大米蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）和轉(zhuǎn)基因克螟稻品系特異性基因序列，分別設計3 對引物探針（表1），用于篩選適用于數(shù)字PCR的引物探針組，相關(guān)序列及其標記由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表 1 sps和克螟稻品系特異性基因引物探針序列Table 1 Sequences of primers and probes for used for PCR amplification of sps and KMD event-specific genes

1.3.3 擴增體系和反應參數(shù)

1.3.3.1 數(shù)字PCR擴增體系

分別向0.2 mL PCR管中加入2×ddPCR Super Mix（no dUTP）10 μL，終濃度為0.32 μmol/L的sps基因及克螟稻品系特異性基因正向引物和反向引物，0.12 μmol/L sps基因熒光標記探針，0.2 μmol/L克螟稻品系特異性基因熒光標記探針，1 μL DNA模板，利用ddH2O補齊至20 μL。

1.3.3.2 數(shù)字PCR擴增參數(shù)及數(shù)據(jù)分析

將配制好的數(shù)字PCR混合液，加入微反應體系生成裝置的加樣孔中生成微反應體系。將微反應體系放置于PCR擴增儀中，按以下參數(shù)進行PCR擴增：95 ℃、5 min（1 ℃/s），1 個循環(huán)；94 ℃、15 s，60 ℃、1 min（1 ℃/s），50 個循環(huán)；98 ℃、10 min（1 ℃/s），1 個循環(huán)；12 ℃保存反應產(chǎn)物。將擴增產(chǎn)物放入讀取儀中對微反應體系進行熒光檢測并計數(shù)。

1.3.3.3 實時熒光PCR擴增體系和參數(shù)

0.2 mL PCR反應管中加入2×Real Master Mix（with ROX）10 μL，終濃度為0.4 μmol/L的正向引物和反向引物、0.2 μmol/L的探針、1 μL DNA模板，利用ddH2O補齊至20 μL。

實時熒光PCR程序為：預變性95 ℃、10 min；95 ℃、10 s；60 ℃、45 s；45 個循環(huán)。

1.3.4 引物探針的篩選及其特異性

以常見轉(zhuǎn)基因作物品系和常見植物基因組DNA為模板，按上述反應條件對本研究各組引物探針的有效性和特異性進行測試。分別采用非轉(zhuǎn)基因大米明恢63和轉(zhuǎn)基因克螟稻品系大米樣品DNA為擴增模板，以ddH2O為空白對照，分別對3 組sps基因和克螟稻品系特異性基因的引物探針進行有效性擴增。隨后選取擴增效率最高的sps基因和克螟稻品系特異性基因引物探針組，利用非轉(zhuǎn)基因大米明恢63、轉(zhuǎn)基因大米TT51-1、KF6 、LL62品系、大豆、玉米、小麥、高粱、油菜、100%及1%轉(zhuǎn)基因克螟稻大米樣品、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因玉米Bt11為模板，驗證擴增效率最高的sps基因和克螟稻品系特異性基因引物探針組的特異性。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因克螟稻定量體系的條件優(yōu)化

利用Qubit核酸蛋白分析儀將質(zhì)量分數(shù)為100%的轉(zhuǎn)基因克螟稻DNA溶液定量到質(zhì)量濃度20 ng/μL，并按6 倍梯度稀釋后分別加入4 μL DNA溶液至內(nèi)源基因sps的微滴式數(shù)字PCR擴增體系中，每個梯度3 次重復進行定量實驗，通過計算每個梯度3 次重復的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），判斷轉(zhuǎn)基因克螟稻定量體系中最適DNA模板添加量。

以質(zhì)量分數(shù)為100%的轉(zhuǎn)基因克螟稻大米樣品為模板，分別考察擴增退火溫度和單雙重微滴式數(shù)字PCR等擴增條件對定量結(jié)果的影響。將微滴式數(shù)字PCR擴增參數(shù)中的退火溫度分別設為58、60、62 ℃和64 ℃，每個梯度3 次重復進行定量實驗，按1.3.3節(jié)所述方法計算最終的克螟稻轉(zhuǎn)基因成分含量。根據(jù)優(yōu)化好的條件，分別比較sps基因和克螟稻品系特異性基因分開擴增的兩個單重微滴式數(shù)字PCR體系與兩個基因合并后的雙重微滴式數(shù)字PCR體系擴增5 次重復結(jié)果的差異。

1.3.6 轉(zhuǎn)基因克螟稻定量方法在芯片式數(shù)字PCR平臺上的適用性

分別在微流體芯片式數(shù)字PCR平臺Bio-Mark?和QuantStudio? 3D對已建立的基于微滴式數(shù)字PCR平臺的轉(zhuǎn)基因克螟稻成分定量檢測方法進行驗證。利用已優(yōu)化的雙重數(shù)字PCR條件，將質(zhì)量分數(shù)為100%的轉(zhuǎn)基因克螟稻標準樣品分別在Bio-Mark?和QuantStudio? 3D微流體芯片式數(shù)字PCR平臺上進行擴增，實時監(jiān)測其擴增曲線，以確保每個微滴/微孔均能有效擴增，針對擴增微反應體系的分布情況等逐一進行分析。

1.3.7 轉(zhuǎn)基因克螟稻定量的絕對靈敏度和線性范圍

利用Qubit核酸蛋白分析儀測定轉(zhuǎn)基因克螟稻大米DNA溶液濃度后按2 倍梯度稀釋，分別稀釋至1.5 pg及0.5 pg，即內(nèi)外源基因的濃度均為1 copies/μL（大米單拷貝基因組質(zhì)量約為0.5 pg[25]）。共稀釋4 個梯度，每個梯度3 個重復實驗，按1.3.3節(jié)進行微滴式數(shù)字PCR擴增，分別檢測其內(nèi)源基因sps和克螟稻品系特異性基因的拷貝數(shù)，根據(jù)內(nèi)外源基因的理論值和實際值繪制相關(guān)性曲線。

1.3.8 數(shù)字PCR與實時熒光PCR對不同含量轉(zhuǎn)基因克螟稻的測定

利用上述實驗建立的雙重數(shù)字PCR定量體系，分別在QX200?微滴式數(shù)字PCR平臺和QuantStudio? 3D微流體芯片式數(shù)字PCR平臺上對質(zhì)量分數(shù)為0.1%、1%、5%的轉(zhuǎn)基因克螟稻樣品的進行定量分析，每個樣品3 次重復定量實驗，根據(jù)儀器自動給出的內(nèi)外源基因拷貝數(shù)濃度，計算二者之比即為樣品中的轉(zhuǎn)基因克螟稻含量。

根據(jù)1.3.3節(jié)的實時熒光PCR擴增體系和參數(shù)，利用已知質(zhì)量分數(shù)為100%、10%、5%、0.5%及0.1%的轉(zhuǎn)基因克螟稻樣品進行實時熒光PCR擴增，基于擴增Ct值制作內(nèi)外源基因的標準曲線，并將0.1%、1%、5%轉(zhuǎn)基因克螟稻樣品內(nèi)外源基因Ct值代入標準曲線中，對這3 個含量的樣品進行定量，將其結(jié)果與微滴式及芯片式數(shù)字PCR定量結(jié)果比較研究。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)字PCR擴增結(jié)束后，每個基因熒光本底值與陽性值之間差異較大，即陰陽性擴增熱點之間界限分明且陽性擴增熱點較為集中，即可判定為擴增結(jié)果良好，擴增圖像可直接用作實驗結(jié)果。

由于數(shù)字PCR是絕對定量技術(shù)，無需標準曲線即可直接測得樣中的內(nèi)外源基因絕對含量。因此，數(shù)字PCR讀取儀逐一對每個微反應擴增產(chǎn)物進行計數(shù)分析后，根據(jù)泊松分布原理計算得到sps和克螟稻品系特異性基因的拷貝數(shù)濃度（copies/μL）。而本研究采用的sps和克螟稻品系特異性基因均為單拷貝基因，按下式計算樣品中轉(zhuǎn)基因克螟稻定量結(jié)果[26-27]：

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針篩選

通過采用實時熒光PCR方法對已設計合成的內(nèi)外源基因引物探針進行篩選，結(jié)果表明所有引物探針均能有效擴增出靶基因，但sps基因引物探針組F2/R2/P2和克螟稻品系特異性基因引物探針組LB-F1/R1/P1信號最強（圖1）。為保證后續(xù)數(shù)字PCR能到達最大效率，本研究選取sps-F2/R2/P2和LB-F1/R1/P1兩組引物探針，用于轉(zhuǎn)基因克螟稻的內(nèi)外源基因定量。

圖 1 sps及克螟稻品系特異性基因的引物探針篩選結(jié)果Fig. 1 Effectiveness of the primers and probes in amplifying sps and KMD event-specific genes

圖 2 sps- F2/R2/P2及LB-F1/R1/P1引物探針組特異性擴增結(jié)果Fig. 2 Specificity of the primers and probes in amplifying sps and KMD event-specific genes

以利用非轉(zhuǎn)基因大米、常見轉(zhuǎn)基因大米、大豆及玉米品系及常見作物基因組為模板，對sps-F2/R2/P2和LB-F1/R1/P1兩組引物探針的特異性進行分析。sps-F2/R2/P2引物探針組僅能擴增出大米成分（含非轉(zhuǎn)基因大米明恢63、轉(zhuǎn)基因大米TT51-1、KF6、LL62品系），對其他禾本科植物玉米、小麥、高粱及大豆、油菜等作物均無擴增。LB-F1/R1/P1引物探針組僅能擴增出克螟稻轉(zhuǎn)基因成分，對其他轉(zhuǎn)基因大米品系和其他轉(zhuǎn)基因作物均無擴增（圖2）。表明這兩組引物探針特異性較好。

2.2 轉(zhuǎn)基因克螟稻微滴式數(shù)字PCR定量體系的條件優(yōu)化

當加入數(shù)字PCR擴增體系中的克螟稻大米樣品DNA量從20 ng/μL按6 倍稀釋6 個梯度后，20 μL擴增體系中DNA量在10 pg～80 ng之間時，目標基因的理論拷貝數(shù)濃度約為8 000、1 333、222、37、6、1 copies/μL。當其含量高達8 000 copies/μL即擴增體系中DNA濃度高達80 ng時，6 次重復的RSD高于25%，而其余幾個濃度梯度，即使DNA含量低至1 copies/μL，6 次重復的RSD仍低于25%（表2），即本研究中克螟稻定量體系中最適DNA添加量在10 pg～13 ng之間。

表 2 克螟稻定量體系模板優(yōu)化Table 2 Optimization of genomic DNA concentration in the quantitative system

當數(shù)字PCR擴增退火溫度分別為58、60、62 ℃和64 ℃時，質(zhì)量分數(shù)為100%的克螟稻轉(zhuǎn)基因相對含量分別為99.29%、100.36%、100.43%、97.39%，所有擴增樣品均能有效區(qū)分陰性和陽性微滴點（圖3）。雖然當退火溫度為60 ℃時偏差最小，但統(tǒng)計學分析顯示這4 組數(shù)據(jù)無顯著性差異（P＞0.05），即退火溫度在58～64 ℃之間時，對定量結(jié)果無顯著性影響。

圖 3 克螟稻定量體系PCR退火溫度優(yōu)化Fig. 3 Optimization of annealing temperature for GM rice KMD in digital PCR

以質(zhì)量分數(shù)為100%的轉(zhuǎn)基因克螟稻大米樣品為模板，根據(jù)優(yōu)化條件，在模板含量為10 ng DNA，退火溫度為60 ℃時，比較分開擴增sps基因和克螟稻品系特異性基因的兩個單重數(shù)字PCR體系與兩個基因合并后的雙重數(shù)字PCR擴增體系定量結(jié)果。單重擴增后定量得到的克螟稻轉(zhuǎn)基因相對含量均值為100.11%，RSD為1.74%（圖4a），而雙重體系的相對含量均值為99.93%，RSD為3.59%（圖4b）。兩種方法定量偏差及多次重復的RSD均遠小于25%，符合目前國際最嚴格的國際標準和歐盟定量方法要求[28-29]，即兩種方法均適用于克螟稻大米樣品的定量。為節(jié)約試劑和時間成本，后續(xù)實驗中，均采用雙重數(shù)字PCR擴增體系進行研究。

圖 4 單重數(shù)字PCR與雙重數(shù)字PCR擴增結(jié)果比較Fig. 4 Comparison of amplification results between singplex and duplex digital PCR

圖 5 100%克螟稻轉(zhuǎn)基因大米在芯片式數(shù)字PCR平臺上擴增Fig. 5 Amplification of KMD GM rice genes on the chip-based digital PCR platform

轉(zhuǎn)基因克螟稻定量方法在芯片式數(shù)字PCR平臺上的適用性利用已優(yōu)化的微滴式數(shù)字PCR擴增條件，分別將質(zhì)量分數(shù)為100%的克螟稻大米樣品在微流體芯片式數(shù)字PCR平臺Bio-Mark?和QuantStudio? 3D上進行擴增，分別得到其內(nèi)源基因與外源基因的實時擴增曲線（圖5）。Bio-Mark?數(shù)字PCR平臺上內(nèi)外源基因各自的765 個反應倉Ct值均較為集中，表明所有微孔均得到了較好的擴增，這也使得定量結(jié)果準確可靠（圖5a、b），相對含量為103.26%，3 次重復的RSD僅為1.7%，定量準確性和精密度均較為理想。QuantStudio? 3D微流體芯片式數(shù)字PCR平臺對質(zhì)量分數(shù)為100%的標準樣品進行芯片式數(shù)字PCR定量檢測時，內(nèi)外源基因所產(chǎn)生的陰性點和陽性點分離較好，無中間模糊區(qū)（圖5c、d），相對含量為99.43%，3 次重復的RSD僅為1.7%。表明本研究所建立的微滴式數(shù)字PCR定量方法在其他微流控芯片式數(shù)字PCR平臺上也能正常擴增，本方法適用性較好。

2.3 轉(zhuǎn)基因克螟稻定量絕對靈敏度和線性范圍

將克螟稻轉(zhuǎn)基因大米DNA溶液按多倍梯度稀釋時，在1～1 000 copies/μL的整個稀釋梯度中，sps與克螟稻品系特異性基因RSD分別在0.63%～2.62%和0.96%～3.62%之間，所有稀釋梯度的RSD均符合國際要求[29]。其內(nèi)外源基因稀釋梯度理論值和實際值線性相關(guān)，R2分別為1和0.999 8。該體系所檢測的濃度梯度均具有很好的線性關(guān)系，并且與理論拷貝數(shù)相符，該檢測體系能夠?qū)康椭? copies/μL的轉(zhuǎn)基因克螟稻進行準確定量。

2.4 轉(zhuǎn)基因克螟稻數(shù)字PCR定量結(jié)果與實時熒光PCR方法定量結(jié)果比較

運用已建立的數(shù)字PCR方法，分別在QX200?微滴式數(shù)字PCR平臺、QuantStudio? 3D微流體芯片式數(shù)字PCR平臺及實時熒光PCR平臺上定量分析轉(zhuǎn)基因質(zhì)量分數(shù)為0.1%、1%、5%的克螟稻轉(zhuǎn)基因大米樣品，將三者結(jié)果進行比較分析。所有平臺定量結(jié)果的3 次重復RSD均小于25%，表明所有操作重復性較好。微滴式和芯片式數(shù)字PCR平臺上3 個梯度轉(zhuǎn)基因大米樣品定量偏差在-0.204%～7.203%之間（表3），即使是針對質(zhì)量分數(shù)為0.1%的克螟稻轉(zhuǎn)基因大米樣品，該方法在不同平臺上的定量結(jié)果精密度和準確性仍然符合要求。表明本研究建立的數(shù)字PCR方法對克螟稻的定量檢測靈敏度可達0.1%。

利用實時熒光PCR方法對質(zhì)量分數(shù)同樣為0.1%、1%、5%克螟稻樣品進行定量時，內(nèi)外源基因的實時熒光PCR擴增效率分別為107.34%和99.62%，符合90%～110%的范圍[30]且內(nèi)外源基因的標準曲線R2都達到0.99以上。根據(jù)各組數(shù)據(jù)RSD可知，本研究中實時熒光PCR的實驗操作重復性較好，且內(nèi)外源基因PCR擴增效率及標準曲線相關(guān)性也符合要求，而3 個梯度轉(zhuǎn)基因大米樣品的定量值其與實際值偏差分別為29.942%、25.426%及-6.738%（表3），遠大于微滴式及芯片式數(shù)字PCR的偏差，尤其是0.1%和1%的克螟稻樣品定量偏差均已超過目前國際通用的定量方法要求[29]。而數(shù)字PCR即使針對質(zhì)量分數(shù)為0.1%的樣品，其偏差最大也僅為7.203%，符合轉(zhuǎn)基因定量中偏差在25%以內(nèi)的要求[28-29]。因此，數(shù)字PCR的定量準確性及靈敏度要好于實時熒光PCR，尤其是針對低含量的克螟稻成分進行定量時，數(shù)字PCR的結(jié)果更為可靠。

表 3 不同含量的克螟稻數(shù)字PCR及實時熒光PCR定量檢測結(jié)果Table 3 Quantitative results of different contents of KMD GM rice by digital PCR and real-time PCR%

3 討論與結(jié)論

雖然數(shù)字PCR技術(shù)將DNA模板進行稀釋分布到大量的獨立反應室中進行單獨擴增，極大降低了反應間的相互抑制，提高了反應效率，但也有研究表明DNA純化方法等條件優(yōu)化措施會對定量結(jié)果產(chǎn)生較大的影響[24,31]。因此本研究對最能影響克螟稻定量反應體系的因素如模板濃度、退火溫度及單雙重反應的差異等情況均進行研究，建立適用于克螟稻品系特異性轉(zhuǎn)基因成分定量的最優(yōu)條件。還有研究表明模板DNA的片段長度會影響模板的均勻分布，進而影響定量結(jié)果[11]，本研究分析隨機酶切、超聲等方式斷裂大米基因組DNA對數(shù)字PCR定量結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)當DNA濃度在合適范圍內(nèi)時，各種處理后的定量結(jié)果與對照相比，其差別無統(tǒng)計學意義（數(shù)據(jù)未列出），即大米基因組DNA無需斷裂處理也可得到較為理想的定量結(jié)果。但此結(jié)果僅適用于克螟稻等轉(zhuǎn)基因大米品系的定量研究，對于其他轉(zhuǎn)基因作物，尤其是小麥等基因組較大的作物，在對樣品精準定量前還需對數(shù)字PCR的各種條件逐一進行優(yōu)化。

在轉(zhuǎn)基因定量中考慮測量值的不確定度很有必要，由于對一些影響因素缺少定量描述，因此在轉(zhuǎn)基因成分定量檢測的不確定度分析方面還沒有一個通行的成熟方法，歐盟聯(lián)合研究中心推薦采用循環(huán)實驗結(jié)果進行某一轉(zhuǎn)基因定量方法的不確定度評估[32]，在缺乏循環(huán)實驗數(shù)據(jù)時，可以利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)依據(jù)國家計量技術(shù)規(guī)范[33]和文獻[30,34]方法對定量的不確定度進行分析。由于數(shù)字PCR無需標準曲線對樣品進行定量，由標準物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性、稀釋梯度及標準曲線等因素帶來的不確定度均無需考慮，這也是利用實時熒光PCR定量檢測轉(zhuǎn)基因成分時最能影響不確定度的部分[35]。此外，數(shù)字PCR為終點讀取，PCR擴增效率的不確定度理論上也可排除在外。因此除取樣的不確定度之外，僅需考慮稀釋梯度、批內(nèi)重復、儀器示值等的不確定度即可。

轉(zhuǎn)基因含量通常以質(zhì)量、體積或者單位個數(shù)（顆粒、DNA以及蛋白分子等）的形式描述純的轉(zhuǎn)基因成分的質(zhì)量與相應成分的總質(zhì)量之比。數(shù)字PCR是通過絕對定量方法測定目的基因在樣本中的拷貝數(shù)，通過內(nèi)外源基因的拷貝數(shù)之比得到轉(zhuǎn)基因成分的含量。在目標基因為單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因品系中，所得內(nèi)外源基因拷貝數(shù)之比即為轉(zhuǎn)基因含量百分比。若目標基因為多拷貝插入或樣本為親本雜交后代，該比值作為相對定量結(jié)果將不夠準確，需作進一步換算。對于定量中的內(nèi)源基因，首先要選擇低拷貝且拷貝數(shù)可穩(wěn)定遺傳的基因，由于單拷貝基因相對于多拷貝基因來說更加穩(wěn)定，在不同作物栽培種中的突變率更低[36]，更加適合用作轉(zhuǎn)基因成分定量中的內(nèi)源基因。而轉(zhuǎn)基因定量分析中的外源基因選擇時，單拷貝的特異邊界序列是首選，尤其是當檢測樣品為混合產(chǎn)品時，對每一品系分別進行定量，得到的轉(zhuǎn)基因成分含量比利用某一外源篩選元件進行定量得到的結(jié)果要更為準確。但也有研究指出以多拷貝基因為對象的檢測由于原始材料中基因的拷貝數(shù)高使得檢測靈敏度更高[37]。本研究中大米內(nèi)源基因sps和克螟稻品系特異性基因均為穩(wěn)定遺傳的單拷貝基因，因此內(nèi)外源基因拷貝數(shù)之比可直接轉(zhuǎn)換為克螟稻轉(zhuǎn)基因成分含量。

轉(zhuǎn)基因標識制度的有效實施依賴于科學可靠的轉(zhuǎn)基因定量檢測方法。本研究結(jié)果表明，基于數(shù)字PCR的定量方法可準確檢測樣品中的從0.1%～100%質(zhì)量分數(shù)的克螟稻轉(zhuǎn)基因大米成分，尤其是在對低含量克螟稻轉(zhuǎn)基因大米成分的定量中，方法的精密度和準確性均高于目前常用的實時熒光PCR方法，可以滿足轉(zhuǎn)基因標識需求，也為我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識閾值的設定提供了一定的借鑒依據(jù)。