劉開放，席志文，黃林娜，惠豐立*

（南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽 473061）

布拉酵母（Saccharomyces boulardii）屬于釀酒酵母亞種[1]，具有降解毒素、調(diào)節(jié)腸道菌群和增強(qiáng)消化道免疫等功能，已被臨床用于治療腹瀉等疾病[2-4]。布拉酵母在動物養(yǎng)殖中也表現(xiàn)出良好效果，作為飼料添加劑在很多國家均通過了相關(guān)認(rèn)證[6-8]，在畜牧業(yè)中應(yīng)用前景廣闊。但布拉酵母高密度培養(yǎng)產(chǎn)量低、價格昂貴，市場上含有1.3×109CFU的布拉酵母菌粉售價約為40～45 元，這也限制布拉酵母推廣應(yīng)用。因此優(yōu)化布拉酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝，對促進(jìn)布拉酵母的推廣應(yīng)用具有重要意義。

高密度培養(yǎng)核心在于為菌體提供合適的營養(yǎng)成分和生長條件。目前針對布拉酵母及釀酒酵母屬的培養(yǎng)基優(yōu)化主要采用單因素、正交設(shè)計和響應(yīng)面優(yōu)化法（response surface methodology，RSM）等方法[9-12]。但酵母菌在發(fā)酵過程中需要多種營養(yǎng)成分，各成分間的相互作用復(fù)雜，具有高度的非線性，傳統(tǒng)優(yōu)化方法在處理非線性問題時具有一定局限性。而人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）能夠反映復(fù)雜的非線性關(guān)系，表現(xiàn)出很強(qiáng)的非線性映射能力，適用于非線性問題的建模、估計和預(yù)測[13-18]。遺傳算法（genetic algorithm，GA）具有全局尋優(yōu)能力，可對模型進(jìn)行全局性的訓(xùn)練和優(yōu)化，獲得最優(yōu)方案[19-22]。本研究通過ANN與GA相結(jié)合，優(yōu)化獲得最優(yōu)培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上，對影響布拉酵母菌生長的多種因素進(jìn)行優(yōu)化，建立適宜的高密度培養(yǎng)條件，為布拉酵母的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

布拉酵母菌（Saccharomyces boulardii）為實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、瓊脂20 g/L、自然pH值。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、自然pH值。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L、硝酸鉀14 g/L、蛋白胨45 g/L、玉米漿15 g/L、酵母營養(yǎng)鹽3 g/L、磷酸二氫鉀0.6 g/L、硫酸鎂0.8 g/L、自然pH值。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-200B型全溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司；CT14RD11臺式離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備有限公司；FR124CN型分析天平 奧豪斯儀器有限公司；SGD-IV型還原糖測定儀 山東省科學(xué)院生物研究所；GS-F2001-MM 1 L四聯(lián)體玻璃發(fā)酵罐、50 L發(fā)酵罐上海顧信生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

搖瓶培養(yǎng)：經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后，取一環(huán)轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h后獲得種子液。以8%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，自然pH值，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：初始裝液量為60%，流加1 mol/L的氫氧化鈉和鹽酸溶液維持pH值，接種量、溫度、pH值、溶氧水平等條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況決定。

1.3.2 指標(biāo)測定

菌體布拉酵母產(chǎn)量的測定：取一定量將發(fā)酵液于8 000 r/min離心5 min去上清液，用生理鹽水洗滌菌體2 次，于105 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量。

葡萄糖質(zhì)量濃度利用全自動還原糖測定儀測定；氨氮質(zhì)量濃度采用甲醛法測定[23]。1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

1.3.3.1 顯著因素篩選及中心組合設(shè)計（central composite design，CCD）試驗(yàn)

在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，篩選得到葡萄糖（A）、硝酸鉀（B）、蛋白胨（C）、玉米漿（D）、酵母營養(yǎng)鹽（E）、磷酸二氫鉀（F）、硫酸鎂（G）7 種培養(yǎng)基組分，借助Minitab16軟件采用N為12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計篩選顯著因素[24-26]。CCD與Box-Behnken試驗(yàn)相比，對各因素的取值范圍更廣，為提高優(yōu)化精確度，借助Design-Expert 8.0對顯著因素進(jìn)行CCD試驗(yàn)。

1.3.3.2 RSM模型的建立

借助Design-Expert 8.0.6軟件，對相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行RSM分析，并模擬出關(guān)于布拉酵母產(chǎn)量和培養(yǎng)基組分關(guān)系的回歸方程模型。此外，使用方差（R2）、均方根誤差（root mean squared error，RMSE）和預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差（standard error of prediction，SEP）對該模型的擬合精度和預(yù)測精度進(jìn)行評估[27-28]，其計算見式（1）～（3）：

式中：Yi,e為實(shí)驗(yàn)值；Yi,p為模型預(yù)測值；n為實(shí)驗(yàn)組數(shù)；為實(shí)驗(yàn)平均值。

1.3.3.3 ANN模型的建立

通過MATLAB 7.8軟件將顯著因素質(zhì)量濃度作為ANN的輸入值、菌體布拉酵母產(chǎn)量為輸出值，運(yùn)用反向傳播方法建立3 層ANN模型。tansig函數(shù)和purelin函數(shù)分別作為隱含層傳遞函數(shù)和輸出層傳遞函數(shù)，訓(xùn)練函數(shù)為trainlm函數(shù)，并對模型的擬合精度和預(yù)測精度進(jìn)行評估。

1.3.3.4 GA尋優(yōu)獲得最優(yōu)配方

將訓(xùn)練完畢的較優(yōu)模型作為GA的擬合函數(shù)，通過MATLAB 7.8軟件中GA工具箱搜尋輸入及輸出變量的最優(yōu)解[28]。具體過程包括：采用二進(jìn)制編碼將各變量的參數(shù)集進(jìn)行編碼；確定群規(guī)模大小，選擇雜交、變異方法和交叉、變異的概率等參數(shù)，隨機(jī)產(chǎn)生初始種群；適應(yīng)度評價；判斷是否滿足終止條件，如不滿足則進(jìn)行循環(huán)，直到滿足條件；輸出GA最優(yōu)解。

1.3.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化和放大培養(yǎng)

以布拉酵母菌體產(chǎn)量為考察對象，利用1 L四聯(lián)體發(fā)酵罐對溫度、接種量、pH值、溶氧等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，繪制其生長曲線。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行流加培養(yǎng)，控制發(fā)酵過程中的糖含量和氨氮含量，直至發(fā)酵結(jié)束。在前期高密度發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用50 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，并對發(fā)酵過程中菌體布拉酵母產(chǎn)量、葡萄糖和氨氮含量變化進(jìn)行監(jiān)控。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行測定，用借助Minitab 16和Design-Expert 8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。P＜0.05，表明具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果及分析

2.1.1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

對發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的7 種成分葡萄糖、硝酸鉀、蛋白胨、玉米漿、酵母營養(yǎng)鹽、磷酸二氫鉀、硫酸鎂質(zhì)量濃度進(jìn)行顯著因素篩選，結(jié)果見表1，各因素分析見表2。

表 1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 1 Plackett-Burman design with experimental results g/L

表 2 各因素影響的主效應(yīng)分析Table 2 Analysis of main effects of medium components

由表2可知，培養(yǎng)基各組分對布拉酵母產(chǎn)量影響顯著性次序?yàn)椋浩咸烟牵镜鞍纂耍居衩诐{＞硝酸鉀＞酵母營養(yǎng)鹽＞硫酸鎂＞磷酸二氫鉀。P＜0.05，在95%的置信區(qū)間內(nèi)對發(fā)酵模型影響顯著，其中葡萄糖、蛋白胨和玉米漿的P值小于0.05，其余因素的P值大于0.05?；貧w方程為：Y=5.182 2+0.727 8A+0.218 9B+0.515 5C+0.411 1D-0.130 0E+0.007 8F+0.102 3G。模型P值為0.006，R2=97.2%，表明擬合程度較好，因此確定葡萄糖、蛋白胨和玉米漿為顯著因素并進(jìn)行CCD試驗(yàn)。

2.1.2 RSM模型建立及分析

借助Design-Expert 8.0.6軟件，對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行RSM分析，并獲得模擬回歸方程，結(jié)果見表4。

表 3 CCD試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 3 Central composite design with experimental and predicted results g/L

該模型的回歸方程Y1=7.53-0.59A+0.058C+0.76D-0.19AC+0.53AD-0.62CD-0.53A2-0.29C2-0.93D2。從表4可以看出，P＜0.05，說明該項在95%的置信區(qū)間內(nèi)顯著，失擬項P值小于0.000 1，說明該模型對布拉酵母發(fā)酵過程的模擬能力較差，不能準(zhǔn)確反映布拉酵母產(chǎn)量預(yù)測值與試驗(yàn)值之間的關(guān)系。

表 4 RSM方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface quadratic regression model

2.1.3 ANN模型及分析

以CCD數(shù)據(jù)作為樣本，使用trainlm算法對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練。采用反向傳播方法建立ANN模型。為防止過度擬合，在保證訓(xùn)練精度的情況下，盡量減少中間隱含層數(shù)量，訓(xùn)練后比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)隱含層神經(jīng)元為6時，能對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確擬合。所以本實(shí)驗(yàn)選擇拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為3-6-1的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。由圖1可以看出，經(jīng)過200 次迭代后網(wǎng)絡(luò)收斂精度達(dá)到10-2，樣本訓(xùn)練能較快達(dá)到收斂。

圖 1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練過程Fig. 1 Training course of BP neural network

2.1.4 RSM模型和ANN模型的對比

圖 2 ANN和RSM模型預(yù)測產(chǎn)量與實(shí)驗(yàn)值對比Fig. 2 ANN and RSM prediction versus experimental values

由圖2可以看出，ANN模型的預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值的擬合程度較好，RSM模型的預(yù)測值則更多地分散于實(shí)驗(yàn)值附近。為進(jìn)一步比較建立RSM模型和ANN模型的擬合能力、預(yù)測能力，分別計算2 個模型的R2、RMSE和SEP。根據(jù)表3計算得出，RSM模型R2=0.89，RMSE=0.46 g/L，SEP=7.26%，ANN模型R2=0.99，RMSE=0.03 g/L，SEP=0.55%。ANN模型擁有更大R2和更小的RMSE、SEP，模型表現(xiàn)出較好的擬合能力以及預(yù)測能力。可能原因是RSM通過二次多項式建立模型，擬合能力不足，不能較好地反映培養(yǎng)基各組分間的非線性關(guān)系。而ANN模型是根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行迭代計算，不像RSM模型需要預(yù)先給定函數(shù)，所以處理非線性問題的能力更強(qiáng)。

2.1.5 GA優(yōu)化

GA可直接對結(jié)構(gòu)對象進(jìn)行相關(guān)操作，不存在求導(dǎo)和函數(shù)連續(xù)性的限定，具有全局尋優(yōu)的優(yōu)勢。綜合考慮精度、收斂速度以及計算規(guī)模等條件，將每代染色體種群設(shè)為30，在求出所有染色體適應(yīng)度后，通過輪盤賭選擇法對種群進(jìn)行選擇，最大迭代次數(shù)為500，采用單點(diǎn)交叉和單點(diǎn)變異，交叉概率為0.5，變異概率為0.08。GA尋優(yōu)過程見圖3。

圖 3 GA優(yōu)化過程中最佳適應(yīng)值和平均適應(yīng)值的變化過程Fig. 3 Evolution of the best and mean fitness in GA

經(jīng)過63 次GA優(yōu)化計算后，GA優(yōu)化得到的布拉酵母產(chǎn)量最大值為8.28 g/L，并獲得3 種成分最佳組成：葡萄糖40.52 g/L、蛋白胨36.8 g/L、玉米漿17.32 g/L。最終得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方：葡萄糖40.52 g/L、蛋白胨36.8 g/L、玉米漿17.32 g/L、硝酸鉀14 g/L、酵母營養(yǎng)鹽1.5 g/L、磷酸二氫鉀0.6 g/L、硫酸鎂0.8 g/L。在該培養(yǎng)條件下，經(jīng)過3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到布拉酵母平均產(chǎn)量為8.21 g/L，說明ANN-GA預(yù)測具有較好的預(yù)測能力。

2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果

在確定的最優(yōu)搖瓶培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上，利用1 L四聯(lián)體發(fā)酵罐對發(fā)酵過程中的溫度、pH值、接種量、溶氧水平等因素進(jìn)行優(yōu)化。

由圖4A可知，布拉酵母在發(fā)酵第21小時進(jìn)入穩(wěn)定期。當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到30 ℃時，布拉酵母產(chǎn)量達(dá)到最大值，超過30 ℃則有下降的趨勢，可能原因是在30 ℃時布拉酵母內(nèi)環(huán)境較為穩(wěn)定，新陳代謝所需酶的活性達(dá)到較高水平，因此確定30 ℃為布拉酵母最適培養(yǎng)溫度。由圖4B可知，當(dāng)接種量為6%時布拉酵母生長較為緩慢，當(dāng)接種量為10%時布拉酵母產(chǎn)量達(dá)到最大，當(dāng)繼續(xù)增加接種量，布拉酵母產(chǎn)量則有下降趨勢。因此確定接種量為10%，后續(xù)優(yōu)化在該基礎(chǔ)上進(jìn)行。

圖 5 pH值（A）及溶氧量（B）對布拉酵母產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect of pH (A) and dissolved oxygen level (B) on dry biomass yield of S. boulardii

由圖5A可知，當(dāng)發(fā)酵過程中pH值為4.0～5.0時，布拉酵母產(chǎn)量呈現(xiàn)出上升的趨勢，pH 5.0時達(dá)到16.63 g/L；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH 5.5時，布拉酵母產(chǎn)量降至15.21 g/L，可能原因是在pH 5.0條件下，培養(yǎng)基中各成分的溶解程度較好，細(xì)胞能夠很好地利用并進(jìn)行生長代謝，過高或者過低的pH值環(huán)境都不利于該酵母菌的生長，因此確定pH 5.0時為最適值。在布拉酵母發(fā)酵過程中，需氧量受菌體濃度、培養(yǎng)基各種成分濃度等多種因素的影響。通過調(diào)節(jié)空氣流量、罐壓和攪拌速率分別控制溶氧量為30%、35%、40%、45%，由圖5B看出，溶氧量控制在40%（空氣流量控制在0.6～1 L/（L·min），攪拌速率400～600 r/min，罐壓0.05～0.07 MPa）的情況下，發(fā)酵水平較為理想。綜上可得，布拉酵母最佳培養(yǎng)條件為溫度30 ℃、接種量10%、恒定pH 5.0、溶氧量40%，在該條件下菌體產(chǎn)量達(dá)到19.43 g/L，后續(xù)優(yōu)化在該基礎(chǔ)上進(jìn)行。

2.3 流加培養(yǎng)方式對布拉酵母發(fā)酵的影響

碳源是異養(yǎng)型微生物所需要的重要能量來源，碳源過低會導(dǎo)致營養(yǎng)不足，菌體無法正常生長代謝，而過高的碳源又會影響細(xì)胞滲透壓[29]。利用1 L發(fā)酵罐研究發(fā)酵過程中碳源質(zhì)量濃度對布拉酵母生長的影響，由圖6A可知，發(fā)酵至第8小時葡萄糖基本消耗完畢，通過流加葡萄糖溶液，控制發(fā)酵液中糖質(zhì)量濃度為1、3、5、7 g/L，菌體產(chǎn)量較未流加時分別提高55.94%、89.50%、80.65%和59.55%。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度增大到5 g/L時，布拉酵母產(chǎn)量呈下降趨勢，可能是由于培養(yǎng)基中糖質(zhì)量濃度過高對細(xì)胞造成滲透壓脅迫。因此確定3 g/L為最適殘?zhí)琴|(zhì)量濃度。

圖 6 葡萄糖質(zhì)量濃度（A）及氨氮質(zhì)量濃度（B）對布拉酵母產(chǎn)量的影響Fig. 6 Effect of glucose (A) and ammoniacal nitrogen concentration (B)on dry biomass yield of S. boulardii

前期Plackett-Burman試驗(yàn)表明蛋白胨對布拉酵母發(fā)酵培養(yǎng)影響顯著，因此選擇蛋白胨為流加氮源。由圖6B可知，當(dāng)控制發(fā)酵中后期氨氮質(zhì)量濃度為0.06 g/L時，布拉酵母產(chǎn)量達(dá)到最大值（42.36 g/L），較未流加蛋白胨時提高15.05%，因此確定最適氨氮質(zhì)量濃度為0.06 g/L。

2.4 50 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

由圖7可知，布拉酵母在0～2 h生長緩慢，菌體產(chǎn)量較低，葡萄糖質(zhì)量濃度由40.52 g/L下降到35.32 g/L。從第2小時開始菌體布拉酵母產(chǎn)量迅速提高，布拉酵母對葡萄糖和氨氮的消耗大幅增加。第8小時時發(fā)酵液中葡萄糖基本消耗完畢，通過流加葡萄糖溶液維持殘?zhí)橇繛? g/L。發(fā)酵至12 h菌體布拉酵母產(chǎn)量為36.25 g/L，此時通過流加蛋白胨溶液維持氨氮質(zhì)量濃度為0.06 g/L，直到第28小時發(fā)酵結(jié)束，菌體布拉酵母產(chǎn)量達(dá)到51.21 g/L。

圖 7 布拉酵母補(bǔ)料培養(yǎng)生長曲線Fig. 7 Growth curve of S. boulardii in fed-batch fermentation

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)對顯著因素進(jìn)行篩選，并采用CCD，通過構(gòu)建ANN模型和RSM模型預(yù)測培養(yǎng)基的組成。結(jié)果表明，在處理該非線性問題時，ANN模型比RSM模型有著更好的擬合和預(yù)測能力。陸震鳴等[13]分別采用ANN模型和RSM模型對樟芝發(fā)酵建立模型，結(jié)果證明，ANN模型的擬合性和預(yù)測能力更強(qiáng)，與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論一致。

培養(yǎng)基組成和質(zhì)量濃度是影響布拉酵母生長的重要因素。本研究在ANN模型的基礎(chǔ)上，通過GA尋優(yōu)獲得最佳培養(yǎng)基配方，搖瓶培養(yǎng)后菌體產(chǎn)量可達(dá)8.21 g/L。雷張?zhí)賉9]利用RSM法優(yōu)化培養(yǎng)基，布拉酵母菌體布拉酵母產(chǎn)量為6.56 g/L。杜曉蒙等[10]通過正交法優(yōu)化布拉酵母培養(yǎng)基，菌體布拉酵母產(chǎn)量為6.5 g/L，為本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的79.9%。本研究將有機(jī)氮源和無機(jī)氮源相結(jié)合，能滿足菌體的不同生長階段需求。酵母營養(yǎng)鹽中含有多種離子，玉米漿含有多種生長因子和前體物質(zhì)，能夠?yàn)椴祭湍妇纳L代謝提供豐富的營養(yǎng)[31]。此外在菌種代謝過程中培養(yǎng)基成分之間作用復(fù)雜，具有高度的非線性，而傳統(tǒng)優(yōu)化方法難以解決該問題，本實(shí)驗(yàn)利用ANN模型與GA優(yōu)化相結(jié)合，提高了優(yōu)化精度。

在布拉酵母的高密度發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，流加葡萄糖和蛋白胨控制適宜的葡萄糖和氨氮濃度，培養(yǎng)28 h后布拉酵母產(chǎn)量達(dá)到51.21 g/L。雷張?zhí)賉9]僅流加單一葡萄糖溶液培養(yǎng)至42 h，菌體布拉酵母產(chǎn)量僅為12.76 g/L，為本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的75%。由此可見在高密度發(fā)酵過程僅流加碳源難以滿足菌體的營養(yǎng)。氮源是構(gòu)成蛋白質(zhì)、核酸及其他氮素化合物的重要物質(zhì)，同時控制適當(dāng)?shù)奶荚春桶钡磕苡行嵘祭湍府a(chǎn)量。