基于GC-MS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法探究特征清香味辣椒粉的香氣特點

王永曉，詹 萍*，田洪磊*，席嘉佩，姬云云，耿秋月

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

辣椒是一年生草本茄科植物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，是飲食中使用的最古老的香料加工原料之一，同時還具有通經(jīng)活絡(luò)、活血化瘀、驅(qū)風(fēng)散寒、開胃健脾、補肝明目等保健功效[1]。干制成粉是辣椒的主要加工形式，對辣椒風(fēng)味的形成有極其重要的影響[2-6]。

辣椒粉中已經(jīng)鑒定了數(shù)百種揮發(fā)性化合物，其中許多化合物有助于辣椒粉風(fēng)味和香氣的形成[7-9]。不同品種的辣椒粉，其風(fēng)味存在很大差異。其原因在于揮發(fā)性物質(zhì)的種類、比例及平衡關(guān)系的不同。對不同品種辣椒粉的呈香物質(zhì)進行分析，對探究辣椒粉的呈香機理，確定不同品種辣椒粉的香氣類型及主要香氣特征有重要意義。高瑞萍等[10]采用頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對遵義朝天紅干辣椒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行鑒定分析，共檢測出39 種物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)雪松烯、月桂烯等烯類化合物是其主要呈味物質(zhì)。熊學(xué)斌等[11]以燈籠椒、紅干椒、越野椒、野山椒4 個辣椒品種為材料，共檢出94 種揮發(fā)性成分。野山椒中主要香氣成分為酯類（己酸己酯、2-甲基丁酸己酯，3-甲基丁酸己酯），紅干椒中主要香氣成分為萜烯類（香橙烯、順-(-)-2,4a,5,6,9a-六氫-3,5,5,9-四甲基-1H-苯并環(huán)庚烯），燈籠椒和越野椒中己醛、2-戊基呋喃相對含量較高。張恩讓等[12]研究6 個貴州辣椒品種，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性成分最多為35 種，最少只有9 種，相比其他相關(guān)文獻檢出揮發(fā)物的數(shù)量偏少，可能由于條件限制，一些含量較高的未知物未被檢出。關(guān)于辣椒粉風(fēng)味品質(zhì)的研究，雖然進行一些相關(guān)報道，但對其特征呈香物質(zhì)的識別及它們在辣椒香氣構(gòu)成中的作用尚未深入研究。

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種廣泛應(yīng)用于減少多元問題維數(shù)的統(tǒng)計技術(shù)[13]，它在反映原始變量的大部分信息的前提下，將多個變量通過線性變換選出較少個數(shù)的重要變量，貢獻率較大的變量保留在前幾個主成分中[14]。例如，董文江等[15]運用PCA技術(shù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，可視化不同地區(qū)生咖啡豆中風(fēng)味前體物質(zhì)的差異性。偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析是一種新型的多元統(tǒng)計方法，它最早產(chǎn)生于化學(xué)領(lǐng)域?，F(xiàn)已在生物信息學(xué)、社會科學(xué)和食品科學(xué)等許多領(lǐng)域得到了成功的應(yīng)用。例如，程媛等[16]采用PLSR建立抗類風(fēng)濕性免疫活性肽的定量構(gòu)效關(guān)系模型。此外，PLSR被認(rèn)為是最強大的多變量校準(zhǔn)技術(shù)之一，可以關(guān)聯(lián)感官和化學(xué)數(shù)據(jù)集。例如，使用PLSR分析羊肉香精[17]、櫻桃酒[18]和醬油[19]的感官屬性和GC-MS數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。

目前，鮮見關(guān)于辣椒粉呈香物質(zhì)與其感官屬性間關(guān)系的相關(guān)報道。因此，本研究應(yīng)用描述性感官分析來描述不同品種辣椒粉的香氣特征；運用GC-MS檢測并鑒定不同品種辣椒粉中普遍存在的揮發(fā)性化合物；基于PCA研究特征清香味辣椒粉的香氣特點；通過PLS1模型識別辣椒粉中與清香味辣椒粉顯著相關(guān)的化合物。預(yù)期研究成果可使人們對清香味辣椒粉的特征香氣有更深入的認(rèn)識，同時為后期其風(fēng)味品質(zhì)的改進提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從新疆大型農(nóng)貿(mào)市場采購8 種不同品種的辣椒：螺絲辣椒（Z1）、羊角椒（Z2）、線椒（Z3）、燈籠椒（Z4）、豬大腸椒（Z5）、牛角椒（Z6）、遲班椒（Z7）和云陽椒（Z8），將其烘制成粉。

正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品（C7～C40）、1,2-二氯苯美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀、 HP-5ms毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取裝置 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

不同品種的辣椒去梗去籽，烘制成粉，通過旋渦混合器在30 s內(nèi)與蒸餾水（1∶1.2，V/V）混合均勻，以通過固體擴散的形式促進揮發(fā)性化合物的釋放。

1.3.2 辣椒粉揮發(fā)性物質(zhì)頂空固相微萃取

準(zhǔn)確稱取6.0 g已混合均勻的樣品于15 mL樣品萃取瓶，加入10 μL的1,2-二氯苯（120 μL/L）作為內(nèi)標(biāo)化合物，將老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入萃取瓶，同時推出纖維頭（距離樣品液面2.5 cm），于50 ℃水浴頂空吸附30 min，將纖維頭縮回迅速插入GC進樣口，在250 ℃解吸6 min，同時啟動GC-MS聯(lián)用儀采集數(shù)據(jù)。

1.3.3 GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為HP-5ms彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：柱溫40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升溫至150 ℃，保持4 min，再以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min；載氣為高純（99.999%）He；流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；不分流進樣。

質(zhì)譜條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃；倍增器電壓1 037 V；接口溫度240 ℃；掃描范圍30～500 u。

定性定量方法：將樣品色譜圖中的峰依次與Willey/NIST質(zhì)譜庫中數(shù)據(jù)進行比對，選取相似度指數(shù)（similarity index，SI）大于800的物質(zhì)，同時與相關(guān)文獻資料中化合物的保留指數(shù)（retention index，RI）進行比對定性。通過公式（1）可計算樣品中待測組分的RI值：

式中：TR（x）、TR（z）、TR（z+1）分別代表待測組分及碳數(shù)為z、z+1正構(gòu)烷的保留時間，且TR（z）＜TR（x）＜TR（z+1）。

采用內(nèi)標(biāo)法進行定量分析，根據(jù)待測組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比，待測組分的相對含量計算見公式（2）：

式中：Ai為待測組分i的峰面積，As為內(nèi)標(biāo)的峰面積，ms為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量/μg；f’為相對質(zhì)量校正因子，假定為1；Wi為待測組分i的質(zhì)量/μg。

1.3.4 感官指標(biāo)的測定

實驗采用6 點間隔尺度（0=無，5=極強）對辣椒粉樣品進行定量描述性感官分析。感官評價小組由事先接受系統(tǒng)培訓(xùn)的12 名成員（6 男6 女，年齡25～35 歲）組成。感官評定在感官實驗室進行，符合實驗室的國際標(biāo)準(zhǔn)[20]。感官評定人員對樣品的香氣特征產(chǎn)生盡可能多的感官屬性，通過對香氣描述詞進行討論篩選，選擇了12 個感官屬性（煮熟蔬菜味、水果味、黃瓜味、甜味、新鮮味、蘑菇味、酸味、苦味、青草味、辛辣味、刺激味、土腥味）建立統(tǒng)一的評定標(biāo)準(zhǔn)進行進一步描述分析，以確保評定結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個樣品重復(fù)評定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

感官數(shù)據(jù)的方差分析（ANOVA）采用SPSS 23.0軟件進行分析，PCA采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 2017軟件繪圖，PLSR分析采用Unscrambler 9.7軟件進行處理，所有數(shù)據(jù)均進行3 次重復(fù)實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒粉感官分析結(jié)果

表 1 8 種辣椒粉樣品的12 個感官屬性得分值Table 1 Mean scores of 12 attributes of eight chilli powder samples in descriptive sensory evaluation

12 位感官評定人員對8 種辣椒粉的感官屬性進行評定，結(jié)果如表1所示。方差分析結(jié)果表明不同品種的辣椒粉樣品的感官屬性（煮熟蔬菜味、水果味、黃瓜味、甜味、新鮮味、蘑菇味、酸味、苦味、青草味、辛辣味、刺激味、土腥味）呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。Duncan多重比較結(jié)果顯示，Z1在蘑菇味、辛辣味和刺激味屬性得分最高；Z2在水果味屬性得分最高，Z3在新鮮味屬性得分最高；Z4在煮熟蔬菜味屬性得分最高，其次是Z3；Z5在苦味屬性顯示相對高的得分；Z6在酸味和青草味屬性得分最高；Z7在青草味屬性有相對高的得分；Z8在黃瓜味屬性得分最高（表1）。結(jié)果表明，不同品種的辣椒粉有其偏向的感官屬性。Z3和Z4由于其獨特的清香味而與其他品種的辣椒粉相區(qū)分。

2.2 PCA結(jié)果

對8 種辣椒粉的12 個感官屬性數(shù)據(jù)進行PCA。前4 個PCs在數(shù)據(jù)組中具有顯著的差異，相應(yīng)累計方差貢獻為85.83%，可解釋樣本的大部分信息。PC1-PC2圖（圖1a）表明所有樣品沿著PC1分離并顯示4 個確定的組。樣品Z1和Z2位于圖的左側(cè)，與辛辣味和刺激味相得益彰。樣品Z3和Z4位于圖的右側(cè)，與新鮮味、煮熟蔬菜味有顯著的相關(guān)性，并具有一定的青草味。樣品Z5、Z7、Z8位于圖的中間，表明這4 個樣品具有所有感官屬性的弱相關(guān)性并且沒有顯著的香味特征。樣品Z6位于圖的右側(cè)，與土腥和酸味有顯著相關(guān)性。進一步分析PC1-PC3圖（圖1b），表明Z4也有一定的酸味，但是它們之間沒有顯著相關(guān)性。綜上所述，清香味辣椒粉的香氣特征是新鮮味、煮熟蔬菜味和青草味的綜合表現(xiàn)的結(jié)果。

圖 1 基于感官屬性評價得分值的不同樣品的PCAFig. 1 PCA score plots of different samples based on sensory evaluation data

2.3 不同品種辣椒粉的揮發(fā)性化合物分析

續(xù)表2 μg/g

表 2 辣椒粉中揮發(fā)性化合物含量Table 2 Concentrations of volatile compounds in chili powder μg/g

續(xù)表2 μg/g

通過GC-MS對不同品種辣椒粉的揮發(fā)性成分進行檢測、鑒定與量化，共檢測出112 種揮發(fā)性化合物（表2），包括烴類15 種、醇類18 種、醛類36 種、酮類16 種、酸類4 種、酯類11 種、雜環(huán)類8 種和4 種其他化合物。所有8 種辣椒粉中，大部分揮發(fā)物的檢測頻率都較高，因此，這些揮發(fā)性化合物可能在辣椒的風(fēng)味表征中起到重要作用，同時也說明不同品種之間的風(fēng)味差異主要是由揮發(fā)性化合物含量的差異造成的。

辣椒粉中有不同種類的烴類化合物，一般來說，烷烴類化合物香氣閾值高，賦予辣椒的香氣作用小，而烯烴和芳香烴相對而言閾值較低，能夠賦予辣椒特殊的香氣[21]，其中雪松烯具有香柏的香氣[4]，檸檬烯具有類似檸檬的香味[22]；辣椒粉中有不同種類的醇類化合物，其中許多甲基支鏈醇來源于氨基酸的代謝作用，常賦予樣品新鮮的氣味，其中1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草的香氣[23]。醛類化合物是構(gòu)成辣椒粉香氣的重要物質(zhì)，賦予香氣的能力較強，主要來源于斯特拉克爾降解反應(yīng)，其中(E)-2-己烯醛具有杏仁和水果香味，個別醛如2-甲基丁醛在高濃度下會產(chǎn)生刺激性風(fēng)味[24]。在辣椒烘制過程中，一定程度的加熱反應(yīng)可能有利于酮類化合物的生成[25]，其中2,3-丁二酮具有飴糖和鮮花香味[26]。酯類化合物主要是辣椒中不飽和脂肪酸如油酸、亞油酸在熱力作用下發(fā)生氧化或裂解反應(yīng)產(chǎn)生的[27]，其中的水楊酸甲酯具有類似冬青的香味[28]。雜環(huán)類中的吡嗪類物質(zhì)，大多是由己醛基和氨基酸的縮合反應(yīng)生成的[29-30]，此類物質(zhì)大部分具有焙烤、焦香氣味[31-32]。

2.4 PLS1分析結(jié)果

PLS1分析多用于單一因變量和多個自變量之間的相關(guān)性。實驗以112 種化合物的濃度作為X變量，3 個感官屬性得分作為Y變量建立PLS1模型，對清香味辣椒粉的主要感官屬性和測定的揮發(fā)性成分進行相關(guān)性分析。處理得到的PLS1模型主要包含3 個主成分（PC1、PC2和PC3），累計解釋方差為62.23%，本實驗僅對PC1-PC2模型進行討論。如圖2所示，結(jié)果表明：1）不同的感官屬性新鮮味、青草味和煮熟蔬菜味和大部分揮發(fā)性化合物位于PC1的右側(cè)；2）沿著PC2軸方向分布的變量可以被不同的感官屬性指標(biāo)所解釋，其中新鮮味和青草味位于載荷圖的上方，煮熟蔬菜味位于載荷圖的下方。兩個Y變量（鮮花和新鮮味）和大部分揮發(fā)性化合物分別位于內(nèi)部和外部橢圓之間，r2分別為0.5和1.0，表明PLS1模型很好地解釋了這些變量。

圖 2 辣椒粉中的揮發(fā)性成分及感官屬性（煮熟蔬菜味、青草味與新鮮味）的相關(guān)性分析Fig. 2 PLS1 correlation loadings plot of volatile components and sensory attributes

為進一步研究揮發(fā)性化合物分別對煮熟蔬菜味、青草味和新鮮味的貢獻，建立PLS1模型進行分析，估計回歸系數(shù)采用Jack-Knife不確定檢驗獲得。結(jié)果表明，揮發(fā)性化合物的校準(zhǔn)模型對于3 個感官屬性（煮熟蔬菜味、青草味和新鮮味）的可信度較低，這是由于預(yù)測值與測量值之間的顯著差異造成的。因此，實驗選擇63 種具有高香氣的揮發(fā)性化合物，建立一個新的PLS1模型，可以更為直觀的發(fā)現(xiàn)各種揮發(fā)性化合物對3 個感官屬性的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖 3 特定揮發(fā)物對感官屬性的顯著性影響分析Fig. 3 Significant influence analysis of specifically selected volatiles to characteristic aroma attrbites

18 種揮發(fā)性化合物在所有3 個感官屬性（煮熟蔬菜味、青草味和新鮮味）中呈正相關(guān)關(guān)系，(Z)-2-戊烯醇和茴香腦與3 個感官屬性都呈負(fù)相關(guān)，其他揮發(fā)性化合物在3 個感官屬性上呈現(xiàn)不同的相關(guān)性；煮熟蔬菜味與β-月桂烯、(E)-2-戊烯醇、(E)-2-己烯醛、辛醛、4-辛烯-3-酮和2-戊基呋喃呈顯著正相關(guān)，與大部分揮發(fā)性化合物呈非顯著正相關(guān)，與己醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛和2,3-丁二酮呈顯著負(fù)相關(guān)。青草味與雪松烯、(Z)-3-己烯醇、己醛、(E)-2-庚烯醛和2-甲基丙酸呈顯著正相關(guān)，與(E)-2-戊烯醛，1-辛烯-3-酮呈非顯著正相關(guān)，與4-甲基-1-戊醇、己醇、辛烯醛和2-甲基丁酸己酯呈顯著負(fù)相關(guān)。新鮮味與3-蒈烯、檸檬烯、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛、2-甲基丙酸和2-甲氧基-3-異丁基吡嗪呈顯著正相關(guān)，與己醇、壬醛和2-甲基丁酸己酯呈顯著負(fù)相關(guān)，而與庚醛、(E)-2-己烯醛和茴香腦呈非顯著負(fù)相關(guān)。

揮發(fā)性化合物濃度不同這導(dǎo)致每個樣品呈現(xiàn)不同的香味特征。盡管Z3和Z4樣品都屬于清香味辣椒粉，但與3 個感官屬性相關(guān)的揮發(fā)性化合物濃度不同。與3 種感官屬性呈正相關(guān)的18 種揮發(fā)性化合物的濃度在Z3中高于Z4，其中4 種與一種或兩種感官屬性呈顯著正相關(guān)：3-蒈烯、檸檬烯、(E)-2-戊烯醇和4-辛烯-3-酮。Z4和其他樣品中的茴香腦的濃度相對較低，且在3 種感官屬性中都呈負(fù)相關(guān)。在Z1樣品中，3-蒈烯、4-甲基-1-戊醇、(E)-2-庚烯醛、1-辛烯-3-酮、2-仲丁基-3-甲氧基吡嗪的濃度較高，這些化合物在2種以上感官屬性中呈正相關(guān)。Z2樣品中有27 種較高濃度的化合物，其中10 個在所有3 個感官屬性上都呈正相關(guān)，而另外17 種在3 個不同的感官屬性上呈負(fù)相關(guān)。Z5樣品中，只有香葉醇和(Z)-2-戊烯醇的濃度相對較高，且后者在3 個感官屬性上都呈負(fù)相關(guān)。Z6和Z8樣品分別有10 種和12 種揮發(fā)性化合物的濃度最低，其中的大多數(shù)在3 個感官屬性上都呈正相關(guān)。枯茗醛是Z7樣品中唯一濃度最高的揮發(fā)性化合物，且在3 個感官屬性上都呈正相關(guān)。

3 結(jié) 論

本研究中感官評定人員通過12 種感官屬性（煮熟蔬菜味、水果味、黃瓜味、甜味、新鮮味、蘑菇味、酸味、苦味、新鮮味、辛辣味、刺激味、土腥味）對8 種不同品種的辣椒粉進行感官評定，結(jié)合PCA結(jié)果，表明特征清香味辣椒粉主要是由感官屬性煮熟蔬菜味、青草味和新鮮味綜合作用的結(jié)果。通過構(gòu)建PLS1模型分析確定出具體哪些揮發(fā)物對特征清香味辣椒粉感官屬性具有較高的貢獻度，結(jié)果表明：煮熟蔬菜味與β-月桂烯、(E)-2-戊烯醇、(E)-2-己烯醛、辛醛、4-辛烯-3-酮和2-戊基呋喃呈顯著正相關(guān)，與大部分揮發(fā)性化合物呈非顯著正相關(guān)，與己醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛和2,3-丁二酮呈顯著負(fù)相關(guān)。青草味與雪松烯、(Z)-3-己烯醇、己醛、(E)-2-庚烯醛和2-甲基丙酸呈顯著正相關(guān)，與4-甲基-1-戊醇、己醇、(E)-2-辛烯醛和2-甲基丁酸己酯呈顯著負(fù)相關(guān)。而新鮮味與3-蒈烯、檸檬烯、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛、2-甲基丙酸和2-甲氧基-3-異丁基吡嗪呈顯著正相關(guān)，與己醇、壬醛和2-甲基丁酸己酯呈顯著負(fù)相關(guān)。通過本實驗可確定特征清香味辣椒粉的香氣特點及其特征揮發(fā)性物質(zhì)，為研發(fā)清香味辣椒粉的相關(guān)產(chǎn)品提供理論依據(jù)。