林肖霞，蔡延渠，高建濱，蔡艷桃，蘇少琴

(1.佛山市南海區(qū)婦幼保健院，廣東 佛山 528200； 2.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006)

哈西奈德是一種皮質(zhì)類固醇，具有良好的抗感染、抗過敏、抗瘙癢和血管收縮作用[1]。局部應(yīng)用不易引起全身性不良反應(yīng)，目前的劑型以液體制劑、乳劑和涂抹劑等為主[2]。皮膚的角質(zhì)層是藥物經(jīng)皮吸收的主要屏障，一般外用劑型通過添加促透劑增加經(jīng)皮吸收效率，但促透劑又促進(jìn)了藥物的全身吸收，容易增加藥物的不良反應(yīng)[3]。脂質(zhì)體是由兩性分子雙層膜包裹而成的具有一個(gè)或多個(gè)水性腔室的微泡，藥物制備成脂質(zhì)體后，可有效提高藥物的穩(wěn)定性和治療指數(shù)[4]，且脂質(zhì)體具有皮膚組織靶向性、兼溶性、緩釋性和無毒性，非常適合外用藥物的劑型改造[5]。為了增加哈西奈德的經(jīng)皮吸收率，降低促透劑的使用量，本研究制備了哈西奈德脂質(zhì)體，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察其透皮性能。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SD大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SYXK(粵)2017-0125。

高效液相色譜儀(日本島津)；SHA-C水浴恒溫振蕩器(金壇市宏華儀器廠)；BT25S電子天平(德國(guó)賽多利斯)；YB-P6智能透皮試驗(yàn)儀(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)；N-2110旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化株式會(huì)社)。

哈西奈德(上海麥克林生化科技有限公司)；膽固醇、VE、卵磷脂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；哈西奈德對(duì)照品(批號(hào)100146-201504，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

1.2 方法

1.2.1 哈西奈德脂質(zhì)體的制備及其包封率測(cè)定方法 稱取哈西奈德粉末100 mg，溶解于30 mL 0.05 mol/L PBS溶液(pH=7.5)，攪拌均勻，將溶液加熱至60 ℃，保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)。卵磷脂、膽固醇和VE依據(jù)不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)比例溶解于無水乙醇中，將此混合溶液使用滴管緩慢滴入哈西奈德溶液中，繼續(xù)攪拌30 min。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇后，超聲波細(xì)胞破碎儀破碎5 min(功率150 W，超聲5 s，停5 s)后，即可獲得哈西奈德脂質(zhì)體，置于4 ℃保存待用[6]。

哈西奈德脂質(zhì)體甲醇破膜后，按《中國(guó)藥典》收錄的黃體酮內(nèi)標(biāo)法[7]測(cè)定哈西奈德的質(zhì)量濃度，色譜條件：Kromasil C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水-乙醚(體積比76∶20∶4)，檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm。哈西奈德脂質(zhì)體甲醇破膜后，測(cè)定的哈西奈德質(zhì)量濃度即為哈西奈德脂質(zhì)體中藥物總量，超速離心法分離哈西奈德脂質(zhì)體與游離哈西奈德，測(cè)定游離哈西奈德總質(zhì)量，包封率=哈西奈德脂質(zhì)體中藥物總量-游離哈西奈德質(zhì)量/哈西奈德脂質(zhì)體中藥物總量×100%。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 以哈西奈德脂質(zhì)體包封率為指標(biāo)，對(duì)哈西奈德∶磷脂(質(zhì)量比，下同)、膽固醇∶磷脂(質(zhì)量比，下同)、VE∶磷脂(質(zhì)量比，下同)和乙醇用量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。各因素選擇范圍分別如下：哈西奈德∶磷脂為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10，膽固醇∶磷脂為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10，VE∶磷脂為0∶10、0.5∶10、0.1∶10、0.15∶10、0.20∶10、0.25∶10，乙醇用量為1、3、5、7、9、11 mL。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化制備工藝，選取A因素(哈西奈德∶磷脂)、B因素(膽固醇∶磷脂)、C因素(VE∶磷脂)和D因素(乙醇用量)，設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)方案，以包封率為響應(yīng)值(Y)，并以-1、0、1分別代表變量的因素編碼，基于Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案按表1進(jìn)行試驗(yàn)，共29次試驗(yàn)，采用Design expert 8.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

表1Box-Behnken試驗(yàn)因素水平和編碼

Table1Factor Level and Coding in Box-Behnken Test

因素水平-101A(哈西奈德∶磷脂)1∶102∶103∶10B(膽固醇∶磷脂)1∶102∶103∶10C(VE∶磷脂)0∶100.5∶101∶10D(乙醇用量/mL)357

1.2.4 體外透皮試驗(yàn) 分別配制2.5 mg/mL的哈西奈德溶液和哈西奈德脂質(zhì)體溶液。大鼠脫頸處死后，苦味酸去毛，取腹部?jī)蓚?cè)皮膚，剔除皮下脂肪。將皮膚置于透皮擴(kuò)散裝置,皮膚角質(zhì)層面對(duì)釋放池，真皮層面向接受池，釋放液為0.3 mL，接受液為5 mL，溫度為(37.5±0.5)℃，振速為150 r/min，分別于2、4、6、8、10、12 h取樣4 mL，并補(bǔ)足等量接受液，按下式計(jì)算累積透過量：

式中，Q為第n次取樣時(shí)的累積透過量；A為擴(kuò)散面積(cm2)；Cn為n時(shí)間點(diǎn)取樣濃度；Ci為1，2，3…n-1時(shí)間點(diǎn)取樣濃度。

再按公式“累積透過率=累積透過量/哈西奈德總量×100%”計(jì)算累積透過率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

從圖1的單因素試驗(yàn)結(jié)果可見，哈西奈德∶磷脂為2∶10、膽固醇∶磷脂為1∶10、VE∶磷脂為0.5∶10、乙醇用量為5 mL時(shí)，哈西奈德脂質(zhì)體具有最高的包封率。因此，在設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中，哈西奈德∶磷脂選擇1∶10、2∶10、3∶10，膽固醇∶磷脂選擇1∶10、2∶10、3∶10，VE∶磷脂選擇0∶10、0.5∶10、1∶10，乙醇用量選擇3、5、7 mL。

圖1各因素對(duì)哈西奈德脂質(zhì)體包封率的影響

Figure1Effects of various factors on encapsulation rate of Hassinide liposomes

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table2Design and results of Box-Behnken response surface experiments

編號(hào)因素ABCD包封率/%12∶102∶100.5∶10455.35222∶102∶100∶10558.03131∶102∶100∶10457.87242∶102∶101∶10344.72252∶101∶101∶10440.43462∶102∶101∶10552.65771∶102∶100.5∶10348.17683∶102∶100.5∶10564.21591∶103∶100.5∶10459.353101∶102∶101∶10449.707112∶101∶100∶10436.915122∶102∶100∶10338.744131∶102∶100.5∶10541.526143∶102∶100∶10439.790152∶101∶100.5∶10330.673162∶103∶100.5∶10344.55172∶102∶100.5∶10459.236182∶103∶100.5∶10450.107192∶101∶101∶10544.196202∶102∶100.5∶10458.059212∶103∶100.5∶10554.367222∶102∶100.5∶10451.157233∶101∶100.5∶10435.379243∶102∶100.5∶10332.129251∶101∶100.5∶10428.853263∶103∶100.5∶10443.478272∶102∶100.5∶10453.807283∶102∶101∶10451.812292∶103∶100∶10455.062

2.2.2 模型建立與回歸分析 采用Design-expert 8.0.6.1對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立的二次多元回歸方程如下：

Y=81.61+2.02A-0.90B-1.09C-1.67D-2.67AB+3.38AC+1.94AD+2.89BC-1.63BD+0.21CD-9.91A2-4.65B2-4.71C2-3.94D2。

對(duì)方程的回歸分析結(jié)果(表3)顯示：模型的F值為5.98，P<0.001，表明模型具有顯著性，只有0.10%的概率是由于噪聲導(dǎo)致F值偏大；失擬項(xiàng)的數(shù)值為0.088 2，>0.05，表明失擬項(xiàng)對(duì)于誤差不顯著，回歸方程擬合度較好。模型決定系數(shù)為R2=0.713 6，表明該模型可以解釋響應(yīng)面中85.68%的可變性；模型中，哈西奈德∶磷脂-VE∶磷脂、哈西奈德∶磷脂-哈西奈德∶磷脂、膽固醇∶磷脂-膽固醇∶磷脂、VE∶磷脂-VE∶磷脂、乙醇-乙醇之間的相互作用對(duì)哈西奈德脂質(zhì)體包封率均具有顯著影響(P<0.05或P<0.01)。

響應(yīng)面曲線圖可直觀反映響應(yīng)值和試驗(yàn)參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系，圖2分別是哈西奈德∶磷脂、膽固醇∶磷脂、VE∶磷脂、乙醇用量之間的相互作用對(duì)脂質(zhì)體包封率的響應(yīng)面圖。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過響應(yīng)面分析，得到最優(yōu)制備工藝如下：哈西奈德∶磷脂為2.1∶10，膽固醇∶磷脂為1.9∶10，VE∶磷脂為0.4∶10，乙醇用量為4.66 mL，預(yù)測(cè)包封率為81.95%。對(duì)最優(yōu)制備工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到實(shí)際包封率為(79.25±4.24)%，與理論值的誤差為2.7%。

2.3 哈西奈德脂質(zhì)體的表征

哈西奈德脂質(zhì)體的表征結(jié)果顯示，哈西奈德脂質(zhì)體形態(tài)圓整，粒徑分布均勻，平均粒徑為(148.2±10.3)nm，Zeta電位為41.67 mV，見圖3。

2.4 哈西奈德脂質(zhì)體透皮性能分析

從表4可見，哈西奈德脂質(zhì)體組的2、4、6、8、10、12 h累積透過量和累積滲透率均顯著高于對(duì)照組。

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Regression analysis of experiment results方差來源平方和自由度均方F值P值模型979.4514979.455.98<0.001A49.05149.054.190.059 8B9.6819.680.830.378 2C14.15114.151.210.289 9D33.50133.502.870.112 6AB28.46128.462.430.141 0AC45.70145.703.910.048 1AD15.20115.201.280.276 1BC33.35133.352.850.113 4BD10.56110.560.900.358 0CD0.1710.170.0140.906 3A2636.501636.5054.44<0.000 1B2140.461140.4612.010.003 8C2143.721143.7212.290.003 5D2100.931100.938.630.010 8失擬項(xiàng)149.581014.960.910.088 2

A.哈西奈德∶磷脂-膽固醇∶磷脂; B.哈西奈德∶磷脂-VE∶磷脂; C.哈西奈德∶磷脂-乙醇; D.膽固醇∶磷脂-VE∶磷脂; E.膽固醇∶磷脂-乙醇;F.VE∶磷脂-乙醇

圖2各因素交互作用對(duì)哈西奈德脂質(zhì)體包封率的影響
Figure2Response surface curves of encapsulation efficiency of Hassinide liposomes by two-factor interactions

A.脂質(zhì)體粒徑分布圖； B.脂質(zhì)體電位分布圖； C.脂質(zhì)體透射電鏡圖。

與溶液組比較：**P<0.01。

3 討論

目前，脂質(zhì)體已被應(yīng)用于多種外用藥物，如丁卡因脂質(zhì)體[8]、維甲酸脂質(zhì)體[9]、鬼臼毒素脂質(zhì)體[10]和氫化可的松脂質(zhì)體[11]等。通過制備脂質(zhì)體可有效改善藥物的經(jīng)皮吸收性能。本研究采用乙醇注入-超聲法制備了哈西奈德脂質(zhì)體。影響脂質(zhì)體制備的因素眾多，單因素實(shí)驗(yàn)不能考察因素與因素之間的相互影響，正交試驗(yàn)注重于科學(xué)的安排試驗(yàn)，尋找最佳的因素水平組合，但考慮因素之間的交互作用時(shí)，試驗(yàn)次數(shù)將顯著增加。為此，本研究采用響應(yīng)面分析法對(duì)工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

響應(yīng)面分析法是通過對(duì)響應(yīng)面等值線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系，并通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法[12]，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、食品學(xué)及醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域[13]。本研究以包封率為響應(yīng)值，對(duì)哈西奈德脂質(zhì)體的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，通過單因素試驗(yàn)設(shè)定4因素3水平試驗(yàn)，共29次試驗(yàn)，為避免實(shí)驗(yàn)操作帶來的異常誤差，每次實(shí)驗(yàn)均測(cè)定了脂質(zhì)體的粒徑，使單次結(jié)果脂質(zhì)體粒徑變化控制在10%內(nèi)。

傳統(tǒng)脂質(zhì)體制備采用三氯甲烷、乙醇和甲醇等有毒有機(jī)試劑，本研究采用了無毒的乙醇進(jìn)行制備哈西奈德脂質(zhì)體，乙醇可以降低脂質(zhì)體之間的水合力，乙醇過量可導(dǎo)致脂質(zhì)體的聚集融合[14]。脂質(zhì)體膜的組成極大影響脂質(zhì)體的包封率，磷脂加入一定比例的膽固醇可以增加脂質(zhì)雙分子膜中分子間的緊密程度，但過量導(dǎo)致膜不對(duì)稱性，導(dǎo)致藥物泄漏。磷脂中的不飽和?；溡籽趸?，因此需在制備過程中加入一定的抗氧化穩(wěn)定磷脂，VE是一種常見的脂質(zhì)體抗氧化劑，但過量使用會(huì)使脂質(zhì)體的形成難度增大[15]。因此，本研究分別選擇了哈西奈德∶磷脂、膽固醇∶磷脂、VE∶磷脂和乙醇用量進(jìn)行了優(yōu)化。

脂質(zhì)體具有雙親性，通過包封可增加藥物的溶解度，促進(jìn)藥物的經(jīng)皮吸收，并在角質(zhì)層形成藥物貯庫，緩釋藥物，避免藥物大量進(jìn)入血液，引起全身性反應(yīng)。為此，本研究考察了哈西奈德脂質(zhì)體的經(jīng)皮吸收性能，結(jié)果顯示哈西奈德脂質(zhì)體組2、4、6、8、10、12 h累積透過量均顯著高于溶液組，累積滲透率可達(dá)到對(duì)照組的2.75倍，具有良好的經(jīng)皮吸收性能。