西雙版納熱帶雨林優(yōu)勢植物假海桐的花氣味及傳粉昆蟲多樣性

王朝雅，楊 培，王 波，彭艷瓊

(1.中國科學院 西雙版納熱帶植物園熱帶森林生態(tài)學重點實驗室，云南 昆明 650223；2.中國科學院大學，北京 100049)

1 引言

傳粉生物學是植物生殖生態(tài)學和進化生物學關注的焦點之一，主要研究植物花部特征對特定傳粉媒介的適應[1]。了解植物的花部特征、開花樣式隨時間的變化以及相應的訪花昆蟲訪問頻率，是理解植物傳粉機制的基礎，對于特定植物的保護具有重要的參考價值。由于植物固著生長的習性，其花粉傳遞往往依賴特定的媒介，約87.5% 的被子植物依賴動物傳粉[2]。在形形色色的傳粉動物中，傳粉昆蟲發(fā)揮著重要的作用，可為90% 的野生植物和75% 的糧食作物傳粉[3]。因此，傳粉昆蟲對植物的繁衍是不可或缺的。它們不僅是自然生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，維持著生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)平衡[4]，同時對于人工生態(tài)系統(tǒng)(如：作物生態(tài)系統(tǒng)和果園生態(tài)系統(tǒng))的經濟效益具有直接影響[5]。

植物的花部特征包括花部構成和花的開放式樣[6]。處于不同開放時期的花在結構、顏色、氣味和提供給訪花昆蟲的報酬上存在著變化，從而影響訪花者的行為[7,8]，其變化的速度與昆蟲的授粉過程緊密相關。而傳粉昆蟲對植物的識別很大程度上依靠花揮發(fā)物這一古老的信號[9]?；馕吨袚]發(fā)性化學物質的組成和含量隨著花的發(fā)育不斷變化[10～12]，一方面顯示了植物發(fā)育階段的變化，另一方面調節(jié)著傳粉昆蟲訪花、采蜜等多種行為[13～15]。尤其是在開花前后，花的揮發(fā)物在質、量上的變化尤為顯著，這種變化會對特定的傳粉者產生顯著的影響[16]。因此，結合植物花的發(fā)育動態(tài)以及揮發(fā)物的變化，能更好地了解植物傳粉昆蟲的多樣性及其互作機制。

在森林生態(tài)系統(tǒng)中，傳粉生物學主要聚焦研究那些花結構特殊、小種群或瀕危的植物，以及專性的傳粉系統(tǒng)[17-19]，針對群落中重要和優(yōu)勢的植物，研究它們的傳粉生物學規(guī)律。熱帶雨林擁有最為豐富的物種，是生物多樣性保護的優(yōu)先區(qū)域。在西雙版納熱帶雨林中，假海桐(Pittosporopsiskerrii)種群數量巨大，是林下層喬木優(yōu)勢樹種，在20 hm2的熱帶雨林動態(tài)監(jiān)測樣地中，假海桐重要值排名第二，影響著群落組分和周圍生境的變化，是決定群落演替的主要因素[20,21]。然而，目前沒有關于假海桐傳粉生物學的報道，也未見其花氣味方面的研究。因此，本研究以熱帶雨林優(yōu)勢種假海桐為研究對象，跟蹤其開花物候、觀察其開花特征，并在花期調查其訪花昆蟲種類及訪花頻次，收集昆蟲傳粉前、后的花氣味，分析其差異，揭示假海桐傳粉生物學特點，為熱帶雨林保護提供依據。

2 材料和方法

2.1 研究地點及材料

研究地點位于云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣境內的中國科學院西雙版納熱帶植物園(21°41′N，101°25′E)和補蚌大樣地內(21°60′N，101°59′E)。西雙版納年平均氣溫21.4 ℃，月平均氣溫最低16.0 ℃(1月)，最高25.7 ℃(7月)，年平均降水量1500 mm，屬典型的熱帶季風氣候，根據降水變化，一年可分為雨季、霧涼季和干熱季[22]。

假海桐(PittosporopsiskerriiCraib)隸屬于茶茱萸科(Icacinaceae)、假海桐屬(Pittosporopsis)，灌木或小喬木，高1～17 m，樹皮紅褐色，小枝近圓柱形，具稀疏的皮孔。葉長橢圓狀倒披針形至長橢圓形，長12～22 cm，寬4～8.5 cm，表面深綠，背面淺綠，具光澤。花序長3～4.5 cm，被微柔毛；花芽綠色，長圓形；花瓣匙形，長5～7 mm，寬1.5～2 mm，黃綠轉白綠，最后為白色，具香味；雄蕊與花瓣幾等長，花絲扁，花藥丁字著生，白色；子房圓錐形，花柱棒狀。核果近圓形至長圓形，長2.5～3.5 cm，徑約2～2.5 cm，白綠色。假海桐喜生于海拔350～1 600 m的山溪密林中，是熱帶雨林下層的優(yōu)勢樹種。國內產云南西雙版納、滄源、紅河等地，在緬甸、泰國、老撾至越南北部也有分布。

2.2 開花動態(tài)觀察

在花期，選擇3株假海桐(P.kerrii)，在每株樹上選取尚未開放的花序，3株共選取20枝花序，從花蕾期開始進行觀察。每天18:00～19:00觀察1次，直到花朵完全開放時為止，每次觀察時記錄當日新開放小花數目。按照Dafni的方法記錄雌雄蕊空間位置及成熟時間[23]，用TTC染色(2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazolium chloride)法測定花粉的活力和壽命，同時采用過氧化氫法和MTS染色法測定柱頭可授性。測定花粉活力的方法：盛花期采集開花天數不同的花藥，置于凹玻片中，用軟毛刷輕刷花粉粒，并用解剖針將已開裂的花粉囊中的花粉粒輕輕挑出，之后滴加含0.5% TTC的蔗糖溶液30 μL，迅速蓋上蓋玻片，放入內置濕濾紙的培養(yǎng)皿中，在37 ℃的黑暗條件中培養(yǎng)3 h后鏡檢。每樣品做10塊玻片的重復，每個玻片選取3～5個不重疊視野進行觀察，計數染色和未染色花粉粒數，計算花粉的染色率，以染色率表示花粉的活力及壽命。測定柱頭可授性的方法：盛花期采集開花后不同天數的小花花柱30個，用鑷子取下花柱，注意不要劃傷柱頭，將每個花柱的柱頭置于凹玻片中，滴加10μL過氧化氫和MTS溶液，完全浸潤柱頭，然后迅速移至體視鏡下觀察，并記錄產生氣泡的情況。若柱頭周圍產生大量氣泡，則顯示柱頭有較強活力，具較強可授性；若柱頭周圍產生少量氣泡，則說明柱頭活力較差，可授性弱；若柱頭周圍未產生氣泡，則顯示柱頭沒有活力，不具可授性。滴加MTS溶液的凹玻片閉光處理30 min后轉移至體視鏡下觀察，再記錄染色情況。若柱頭呈深藍紫色，則顯示柱頭有活力，具有可授性；若柱頭淺染色說明柱頭活力差，可授性弱；若柱頭顏色不變，則顯示柱頭沒活力。此外，選取41枝花序(共1204朵小花)，在花蕾期進行套袋隔離處理，避免昆蟲異花授粉，以檢查假海桐的自交結實情況。

2.3 訪花昆蟲觀察

假海桐開花有始花期、盛花期和末花期之分，在開放花朵較多的盛花期直接觀察、拍照記錄昆蟲的訪花頻次，觀察有無接觸到雄蕊和柱頭的傳粉行為，當訪花昆蟲接觸到雄蕊和柱頭時，記為一次訪花傳粉。野外難于直接鑒定的昆蟲種類，采回室內，制作標本進行種類鑒定。在3株樹上開展系統(tǒng)觀察，每株樹在東西南北4個方向，每個方向觀察5 min，共觀察20 min，在10:00～18:00期間對3株樹間輪流觀察，每株樹觀察8次，連續(xù)觀察3 d。

2.4 假海桐花化學揮發(fā)物的收集和鑒定

2.4.1 動態(tài)頂空吸附法收集假海桐花化學揮發(fā)物

在假海桐出現(xiàn)花蕾時，用120目白色紗網袋套袋隔離傳粉昆蟲。每株樹進入盛花期時(此時昆蟲訪問頻率明顯增加，而花藥完整，花瓣新鮮，未顯衰敗)，于上午11:00～12:00 移走紗網袋，迅速采集同一株上的30朵花，及時收集傳粉前的花氣味。傳粉后的花(花藥不完整，花瓣不新鮮)在下午16:00～17:00進行，在同一株樹上再采集30朵花，收集傳粉后的花氣味。

采用動態(tài)頂空吸附法收集花氣味[24]。主要工作流程：將采集好的傳粉前、后的各30朵花分別裝入無味透明的聚氟乙烯采集袋(2 L, Teflon FEP, 大連德霖氣體包裝有限公司)中，袋兩端分別留有進氣口和出氣口。首先，用氣體采樣儀的出氣口，將空氣通過活性碳管(外徑6 mm，長75 mm, SigmaAldrich, 美國) 進行凈化，之后氣體經由進氣口進入袋中，由另一氣泵通過出氣口將揮發(fā)的氣味抽出，導入Porapak Q [100 mg (50 mg)-1, 60/80目, Sigma-Aldrich, 美國]吸附管(外徑6 mm，長75 mm)中進行吸附。通氣端和出氣端空氣流量控制流速均為250 mL/min。連接裝置器件之間均用無味的特氟隆管(PTEE, VICI Jour, 瑞士)連接，同時用未放置花的空采樣袋作為對照。采集時間3.5 h，采集完畢的樣品用錫箔紙包裹吸附管并裝入密封袋內，置于冰盒帶回實驗室。用色譜純正己烷洗脫3次，收集約0.5 mL洗脫液于2 mL棕色進樣瓶中。隨后用氮吹儀濃縮至250 μL，置于-20 ℃冰箱中保存待分析。最終，傳粉前花氣味收集到10個樣品，傳粉后的花氣味收集到9個樣品。

2.4.2 花揮發(fā)物的鑒定

收集到的19個樣品均采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS; GC, HP-7890A; MS, HP-5975C; Agilent Technologies, USA)進行分析。

(1)GC分析條件：HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm × 0.25 μm)；進樣采用分流模式，分流比5∶1，分流流量5 mL/min。進樣量為1 μL，柱起始溫度40 ℃保持0 min，以每分鐘3 ℃升溫至150 ℃；再以每分鐘10 ℃升至260 ℃，保持5 min。進樣口溫度 250 ℃；載氣為高純 He，流速9 mL/min。

(2)MS分析條件：離子轟擊源設為掃描功能，掃描范圍50～550 amu，離子源溫度 230 ℃；四級桿溫度150 ℃。

(3)揮發(fā)物的鑒定：假海桐花揮發(fā)性化合物的分析鑒定首先利用儀器自帶的標準譜庫(NIST08)檢索目標化合物，然后根據保留時間計算保留指數，參考NIST Chemistry WebBook(https://webbook.nist.gov/chemistry/)上各化合物的保留指數，以確定揮發(fā)物的化學成分。運用峰面積歸一化法計算氣味各組分的相對百分含量。

2.5 數據分析

使用Microsoft Excel 2010和R3.5.1軟件對數據進行分析。對于假海桐花氣味的數據分析：用t檢驗分別比較各個化合物傳粉前后相對含量的差異。然后采用Vegan包，基于Bray-Curtis距離構建的距離矩陣，采用非度量多維度尺度分析(NMDS, nonmetric multi-dimensional scaling)方法[25]比較假海桐傳粉前后的揮發(fā)性化合物構成相似性。該方法基于Bray-Curtis距離構建兩兩樣本間的距離矩陣，對多種化合物的高維數據進行降維處理，根據Bray-Curtis距離計算NMDS距離，得到stress值(這個值表示NMDS距離與Bray-Curtis距離的擬合程度，越小表明擬合越好)，最后在二維平面上顯示假海桐花傳粉前后化合物組成的NMDS距離。然后用相似性分析(ANOSIM, analysis of similarity)進行傳粉前后化合物構成差異顯著性檢驗。ANOSIM針對多元數據(多個因變量)，采用了重抽樣的方法，比較類別間(傳粉前、后)的整體統(tǒng)計差異。

3 結果和分析

3.1 假海桐開花特性

假海桐于12月初開始出現(xiàn)花芽，翌年2月下旬第一朵花苞開放，進入始花期。花序的開花次序為自上而下開放，每天開放1～27朵不等，通常為4～8朵。受溫度和濕度的影響，晴天開花數較多，雨天和陰天開花數較少。一般一個花序自第一朵開放到最后一朵開完需5～10 d，單花期為3～4 d。單株始花期后5～7 d進入盛花期，花期持續(xù)時間8～10 d。假海桐樹間花期不同步，主要集中在2～3月份，種群內花期可持續(xù)6～7個月。假海桐開放的花朵中，花瓣5瓣，雌蕊1枚，雄蕊5枚，花藥與柱頭等長；假海桐雌雄蕊異步成熟，花粉活力在開花初期表現(xiàn)最高，之后緩慢下降，花粉壽命共48 h；開花初期柱頭不具可授性，在開放24～48 h時柱頭可授性最高，開放72 h時柱頭有較弱的可授性，整個柱頭可授期約為72 h(表1)。在套袋隔離防止異花授粉的試驗中，1204朵假海桐花，最終僅有1果發(fā)育成熟，自交率僅0.07%，說明假海桐依賴昆蟲傳粉，偶爾自交可結實。

表1 假海桐花粉活力和柱頭可授性

-: 柱頭不產生氣泡或未被染色，不具可授性； +: 柱頭產生少量氣泡或被淺染色，具較弱可授性；++: 柱頭產生大量氣泡或被染為深藍紫色，具強可授性

3.2 訪花昆蟲種類

在假海桐盛花期，對訪花昆蟲進行系統(tǒng)觀察和記錄，共觀察到訪花昆蟲54種，記錄到昆蟲訪花847次，其中膜翅目昆蟲占70.5%，主要是蜜蜂、螞蟻、胡蜂和泥蜂；鱗翅目蝴蝶類占18.0%，包括云南麗蛺蝶(Parthenossyvia)、幻紫斑蛺蝶(Hypolimnasbolina)、龍女鋸眼蝶(Elymniasnesaea)等；雙翅目昆蟲占10.6%，有食蚜蠅、麗蠅、寄蠅等；鞘翅目昆蟲占0.8%，涉及葉甲、象甲、隱翅甲等，以及僅占0.1%的半翅目昆蟲刺緣蝽(Cletus trigonus)(圖1和圖2)。總體上，隸屬于膜翅目的大蜜蜂(Apisdorsata)訪花頻次最高，達450次，占53.1%，其次是東方蜜蜂(A.cerana)訪花103次，占12.2%，云南麗蛺蝶訪花56次，占6.6%，其余昆蟲訪花總計238次，占28.1%。其中大蜜蜂和東方蜜蜂每次訪花均伴有接觸雌雄蕊的傳粉行為，并且其頭部、足、背部都攜帶了花粉，可以確定大蜜蜂是假海桐最為優(yōu)勢的傳粉昆蟲。

A：大蜜蜂；B：食蚜蠅；C：云南麗蛺蝶；D：三錐象

圖2 假海桐訪花昆蟲種類及比例

3.3 傳粉前后假海桐花釋放的揮發(fā)物類別及含量變化

從假海桐傳粉前后的花氣味中共鑒定出13種化合物(表2)，這些化合物可以歸為3大類：包括9種萜烯烴類化合物、3種芳香族化合物及1種脂肪酸衍生物。3類化合物在傳粉前的相對含量分別為萜類98.21%、芳香族化合物0.84%和脂肪酸衍生物0.95%，而傳粉后3類化合物含量變化分別為88.52%、10.16%和1.32% (圖3)。

3.4 傳粉前后假海桐花各揮發(fā)物相對含量的變化

傳粉前花氣味共收集到12種化合物，主要成分(相對含量>5%)包含5種：α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷基甲醇(44.17%)、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇(21.73%)、芳樟醇(8.51%)、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-呋喃-3-醇(9.51%)和羅勒烯(6.46%)。傳粉后花氣味有13種化合物，新增化合物對仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚(4.35%)，其它主要成分與傳粉前的一樣，但相對含量發(fā)生變化：α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷基甲醇(35.77%)、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇(22.07%)、芳樟醇(12.26%)及羅勒烯(5.67%)(表2)?？梢钥闯?，α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷基甲醇在假海桐傳粉前后的揮發(fā)物中含量均最高，并且傳粉前顯著高于傳粉后(P<0.05)。隨著昆蟲的傳粉進程，2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-呋喃-3-醇相對含量顯著減少(P<0.05)，而樟腦、對乙基苯乙酮和3-乙基苯乙酮的相對含量顯著增加(P<0.05)，其余化合物傳粉前后相對含量變化不大(圖4)。

表2 傳粉前后假海桐花化學揮發(fā)物的構成

圖3 傳粉前后假海桐花氣味化合物類別相對含量

*：顯著；n.s.：不顯著；A：α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷基甲醇；B：順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇；C：芳樟醇；D：四氫-2,2,6-三甲基-6-乙烯基-3-吡喃酮；E：(3R，6R)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-吡喃-3-醇；F：2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-呋喃-3-醇；G：羅勒烯；H：苯甲酸甲酯；I：對乙基苯乙酮；J：3-乙基苯乙酮；K：樟腦；L：(E)-2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇；M：對仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚

圖4假海桐花揮發(fā)物中的13種主要化合物在傳粉前后的變化

3.5 假海桐傳粉前后花氣味的相似性

通過對假海桐花傳粉前10個樣品和傳粉后9個樣品的揮發(fā)物進行NMDS分析(Stress=0.13，R2=0.98)，并用多邊形將它們在二維平面上的分布表示出來(圖5)。結果顯示：假海桐花被傳粉前后揮發(fā)物構成在NMDS距離上雖然有部分重疊，但明顯分離，且ANOSIM檢驗結果表明傳粉前后假海桐花化學揮發(fā)物構成組間差異顯著(R=0.16，P<0.05)。

圖5 假海桐花傳粉前后相似性的多維尺度分析

4 討論

分布于熱帶雨林林下的假海桐花小、簇生，白色，花藥與柱頭等長，具有花蜜，味清新。其花期早，種群花期持續(xù)時間長，單花期3～4 d，開花第一天花粉活力最高，但柱頭不具可授性，這有利于促進異交授粉。我們的研究結果顯示開花的第2～3 d花粉活力與柱頭可授性同步，以及花藥與柱頭等長特點，可能存在自交親和，進一步通過花期隔離授粉試驗顯示假海桐自交率僅0.07%，說明假海桐依賴昆蟲傳粉，偶爾自交可結實。假海桐也顯示了蟲媒花的特點：白天開放，以明亮的顏色及清新而不濃郁的花香吸引傳粉者，其兩側對稱的花形，可以為昆蟲提供著陸平臺，便于昆蟲落下并深入花中采蜜授粉。本研究中共觀察到假海桐花期訪花昆蟲54種，物種組成多樣性較高，多種傳粉昆蟲有助于保障林下假海桐的繁殖成功。

在自然界的傳粉昆蟲中，膜翅目蜜蜂總科(Apoidea)的蜂類是最為理想的傳粉昆蟲[26]。在對假海桐訪花昆蟲的觀察中，記錄到的膜翅目昆蟲包括蜜蜂、螞蟻、胡蜂和泥蜂，其中大蜜蜂的訪花頻次占總頻次的53.1%，并且每次訪花都伴隨著采粉行為，可以確定假海桐最為優(yōu)勢的傳粉昆蟲是大蜜蜂。有研究表明，膜翅目蜜蜂科昆蟲偏愛黃色、藍色、白色的花[27]，假海桐花色從黃綠轉白綠，最后為白色，因此簇生的白色花也可能有利于吸引大蜜蜂傳粉。大蜜蜂飛行能力強，可克服熱帶雨林植株各冠層間距較大的困難，是實現(xiàn)花粉散布和基因流動的主要動力[28]。同時大蜜蜂具有很好的傳粉服務功能，是熱帶雨林大多數植物和多種熱帶農作物的有效傳粉昆蟲[29～31]。假海桐能在郁閉度極高的熱帶雨林林下層擁有最高的種群數量，可能與為之傳粉的大蜜蜂息息相關。

假海桐花傳粉前后揮發(fā)物共鑒定出化合物13種，由萜烯類化合物、脂肪酸衍生物及芳香族化合物三類構成。傳粉前后含量最高的化合物都是α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷基甲醇，該種化合物常見于植物花瓣和葉子的揮發(fā)性油中[32～34]，是假海桐花氣味的基本組成物質。植物揮發(fā)物通常以“泛化”和“特化”兩種方式實現(xiàn)其對傳粉者的特異性吸引[35]。假海桐花氣味中含量最多的物質雖不常見于茶茱萸科其他花揮發(fā)物中，但所含芳樟醇、羅勒烯、樟腦等是植物花揮發(fā)物中常見的物質[36]，可見其執(zhí)行的是“泛化”的化學通訊策略。有報道苯酚類物質對傳粉昆蟲具有強烈的引誘作用[13]，傳粉后新出現(xiàn)對仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚可能有活性，是吸引還是趨避值得深入研究。聚類分析時傳粉前后化學揮發(fā)物部分重疊的原因推測可能是假海桐傘狀、簇生的花序，小花授粉程度差異導致的。最終，白色簇生的花朵及花釋放的多種揮發(fā)物，共同從視覺和嗅覺方面吸引昆蟲為假海桐傳粉。更為重要的是在高度郁閉的林下層，假海桐冬春較早開花，錯開花期有利于吸引傳粉昆蟲，保障假海桐的繁殖。

近幾十年來，版納地區(qū)發(fā)展以橡膠樹為主的經濟作物種植，使得大量的原始森林遭到砍伐。隨著原始森林的破碎化和人為干擾的加劇，導致該地區(qū)生物多樣性急劇下降[37,38]。有限的熱帶雨林是生物多樣性保護的優(yōu)先區(qū)域，本研究第一次針對復雜的熱帶雨林生態(tài)系統(tǒng)，從林下層最為優(yōu)勢和重要的假海桐著手，開展傳粉生物學研究，初步的研究數據從傳粉繁殖角度揭示了假海桐大種群，成功占據林下層生態(tài)位的適應性策略，進一步研究將為熱帶雨林保護、恢復提供參考。