膽鹽對植物乳桿菌NCU116應(yīng)激基因和關(guān)鍵生理指標(biāo)的影響

胡敏，黃濤，彭珍，趙雪婷，熊濤*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室(南昌大學(xué))，江西 南昌,330047) 2(南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌,330031)

植物乳桿菌常見于工業(yè)發(fā)酵食品，如奶油、肉類及許多傳統(tǒng)蔬菜發(fā)酵制品中，也是人類腸道乳酸菌的一種[1]，能夠通過胃腸道并定殖于腸道發(fā)揮益生作用[2]。植物乳桿菌NCU116分離自傳統(tǒng)四川泡菜，具有良好的耐酸、耐膽鹽和抑菌性能，以及調(diào)節(jié)腸道菌群、緩解便秘、抑制大鼠血脂紊亂與脂肪肝病變等益生功能[3-5]。目前已被應(yīng)用于果蔬等植物原料的發(fā)酵產(chǎn)品研究、開發(fā)與生產(chǎn)，具有較高的研究價值和應(yīng)用前景。

膽鹽耐受能力是益生菌的重要特性之一，有助于益生菌通過胃腸環(huán)境并在腸道定殖(正常情況下，人體腸道中的膽鹽含量約為0.3%～0.5%[6])。之前的研究大多數(shù)側(cè)重于對耐膽鹽益生菌株的篩選，對于耐膽鹽機制的研究較少，近年來相關(guān)研究逐漸受到關(guān)注[7]。

隨著測序成本的降低，由益生菌全基因組獲得的編碼基因信息越來越多，也使得通過生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等手段研究益生菌在膽鹽環(huán)境下的應(yīng)答機制成為可能[8]，F(xiàn)LAHAUT等對糞腸球菌的膽鹽脅迫研究發(fā)現(xiàn)，其體內(nèi)有45種蛋白質(zhì)表達增強[9]；BRON等對植物乳桿菌WCFS1使用DNA微陣列研究其膽鹽誘導(dǎo)基因，發(fā)現(xiàn)分別有62和28個基因轉(zhuǎn)錄水平在生長期間下調(diào)和上調(diào)[10]。乳酸菌中的膽鹽水解酶也可將對菌體毒性較高的初級膽鹽轉(zhuǎn)化為毒性較低的次級膽鹽，從而提高乳酸菌的膽鹽耐受能力[11]。但不同乳酸菌菌株受到膽鹽脅迫的應(yīng)激反應(yīng)不同，影響機制也尚未完全明確，文章以具有多種益生功能的植物乳桿菌NCU116為研究對象，利用RT-qPCR技術(shù)研究膽鹽脅迫條件下基因表達的變化，并考察了關(guān)鍵生理指標(biāo)受膽鹽脅迫的影響，在一定程度上為NCU116所具有的益生功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：植物乳桿菌NCU116，由南昌大學(xué)重點實驗室自四川傳統(tǒng)泡菜中分離鑒定并保存。

MRS固體培養(yǎng)基(1 L)、RNA prep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒、Real Master Mix(SYBR Green)熒光定量PCR試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；TPrimeScriptTMRT試劑盒，Takara公司。

牛膽鹽、溴化丙錠(PI)、磺基水楊酸，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；2720Thermal Cycler型PCR儀器，Applied Biosysterms公司； 752s紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司； ST16R高速低溫離心機，賽默飛世爾科技有限公司；1260高效液相色譜儀，安捷倫公司；熒光定量PCR儀， Applied Biosysterms公司；NanoDrop2000超微量分光光度計，賽默飛世爾科技有限公司； fastPreP-24TM5G高速裂解樣品制備儀，安倍醫(yī)療器械貿(mào)易(上海)有限公司；DM3000LED熒光顯微鏡，徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌NCU116的耐膽鹽測試

將活化3代的穩(wěn)定期植物乳桿菌NCU116在膽鹽質(zhì)量濃度為0、0.3、0.5、0.7、1 g/100 mL的MRS培養(yǎng)基中37 ℃孵育0 h(將NCU116添加于含膽鹽的液體培養(yǎng)基后立即取樣，孵育時間小于5 s)和2 h并測定其活菌數(shù)。

1.3.2 基于RT-qPCR檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄水平變化

1.3.2.1 總RNA提取

將活化3代的穩(wěn)定期NCU116在膽鹽質(zhì)量濃度為0、0.3、0.5、0.7、1 g/100 mL的MRS培養(yǎng)基中37 ℃孵育2 h后，按照RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒說明書提取菌體總RNA。

1.3.2.2 反轉(zhuǎn)錄

按照PrimeScriptTMRT試劑盒說明書進行。

1.3.2.3 基因選取與引物設(shè)計

選取16SrRNA為管家基因，在GenBank網(wǎng)站查詢?nèi)抗芗一蚝湍康幕虻男蛄?，引物設(shè)計軟件為Oligo7，管家基因和目的基因引物序列如表1所示。生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，PCR擴增后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)單一條帶表明引物具有特異性。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primers sequence for quantitative PCR

續(xù)表1

基因名稱引物序列(5′-3′)產(chǎn)物/bp核糖核酸酶HIrnhAAATTTCTTGCCGCCATTGCT(F)CGCCAGCTCGACACTGAAAG(R)143細(xì)胞分裂蛋白ftsZCGCTCTGATGGGTATTGGCT(F)CACCCGTGATGTTCAGCAAG(R)131生物素轉(zhuǎn)運蛋白BioYbioYATTCCCGTCCCGATTGTGTT(F)AGCAACGAGATAGCCACCCG(R)186二價金屬陽離子轉(zhuǎn)運蛋白MntHmntHGCAAGACTTAGCACAAGCCA(F)CACGCCGAATGCCAAATCTC(R)224支鏈氨基酸ABC轉(zhuǎn)運蛋白通透酶livHATCATTGCCGACCCAGTTGT(F)ATTCCAAAACCGCAACCGAG(R)123

1.3.2.4 qPCR實驗

按照Real Master Mix(SYBR Green)熒光定量PCR試劑盒說明書進行熒光定量PCR實驗，基因相對表達量變化用ΔΔCt法計算，實驗設(shè)定空白對照的基因表達量為1。

1.3.3 關(guān)鍵生理指標(biāo)測定

1.3.3.1 菌體表面疏水性和自凝聚能力的測定

菌體表面疏水性測試方法參考ROSENBERG的方法，并作一定的修改[12-13]。具體操作為：不同質(zhì)量濃度的膽鹽脅迫2 h后，離心收集菌體，菌懸液與二甲苯等體積混勻，室溫靜置30 min后使用紫外分光光度計檢測水相于600 nm處吸光值，重復(fù)3次。表面疏水性(H%)按公式(1)計算：

(1)

式中：A0和A2分別為與二甲苯混勻前后水相在600 nm下測得的吸光值。

菌體自凝聚能力測定方法[14]：不同質(zhì)量濃度的膽鹽脅迫2 h后，離心收集菌體，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至108CFU/mL，渦旋振蕩10 s后，37℃靜置0、2、4、6及24 h,并分別測其在600 nm處的吸光值，重復(fù)3次。自凝聚能力按公式(2)計算：

(2)

式中：A0和At分別為靜置0 h和th時水相在600 nm下測得的吸光值。

1.3.3.2 胞內(nèi)葡萄糖和乳酸含量的測定

膽鹽脅迫2 h后，取1 mL菌液離心去上清，加入1 mL PBS緩沖液，經(jīng)高速裂解樣品制備儀破碎細(xì)菌后離心，取上清，過0.22 μm膜后使用1260高效液相色譜儀檢測。

1.3.3.3 胞內(nèi)氨基酸含量的測定

膽鹽脅迫2 h后，高速裂解樣品制備儀破碎菌體后離心，取上清；加入2%磺基水楊酸9 mL沉淀蛋白質(zhì)后離心，取上清，經(jīng)0.22 μm膜過濾后送樣。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

做圖軟件為Origin 9，分析軟件為SPSS 22。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌NCU116的耐膽鹽測試

膽鹽具有兩親性，可直接作用于菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起一些鑲嵌在細(xì)胞膜中的生物酶類失活，從而導(dǎo)致跨膜轉(zhuǎn)運功能紊亂，膽鹽濃度過高則會直接溶解細(xì)胞膜中的脂質(zhì)，使細(xì)胞質(zhì)等內(nèi)容物從胞內(nèi)流出，可直接導(dǎo)致菌體死亡，但不同乳酸菌菌株對膽鹽的耐受能力不同[15]。一般情況下，乳酸菌在膽鹽質(zhì)量濃度0.3～0.5 g/100 mL下耐受能力較弱，存活率最低可降至31.8%[16-17]，在胡斌等的研究中，植物乳桿菌ST-Ⅲ在膽鹽質(zhì)量濃度1 g/100 mL中完全死亡[13]。膽鹽對NCU116的生長有一定的抑制作用，但其在0.3 g/100 mL的膽鹽脅迫2 h后，活菌數(shù)仍可保持在108CFU/mL以上；隨著膽鹽質(zhì)量濃度的提高，NCU116的耐受能力逐漸降低，但其在高達1 g/100 mL的膽鹽質(zhì)量濃度下依然能夠保持較高的活性(107CFU/mL)，而益生菌想要在人體發(fā)揮作用，只需使其活菌數(shù)維持在106CFU/mL以上即可[18]。表明NCU116具有較強的膽鹽耐受能力，具有在人體發(fā)揮益生功能的潛力(圖1)。

圖1 膽鹽脅迫下植物乳桿菌NCU116活菌數(shù)變化Fig.1 Changes of viable counts of L. plantarum NCU116 under bile salt stress

2.2 基于RT-PCR檢測關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平變化

研究表明，膽鹽擴散到胞內(nèi)，會導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)受到干擾而錯誤折疊，當(dāng)折疊過量時將導(dǎo)致細(xì)菌生長停滯甚至死亡[18]。分子伴侶蛋白可有效隔離外源性有害物質(zhì)，修正蛋白質(zhì)的錯誤折疊，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，以及幫助修復(fù)細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運以抵御環(huán)境脅迫等作用[19]。在劉倩穎等[20]的研究中，植物乳桿菌在高滲透壓脅迫時，分子伴侶蛋白基因dnaK、dnaJ、groES、groEL的相對轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)；L.caseiZhang在受到膽鹽脅迫時，基因groEL、dnaK轉(zhuǎn)錄水平也上調(diào)[21]。NCU116在膽鹽脅迫條件下，基因dnaK和groES轉(zhuǎn)錄水平受膽鹽誘導(dǎo)顯著上調(diào)，在膽鹽質(zhì)量濃度高于0.5 g/100 mL時，基因dnaK轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)15.0和20.6倍，基因groES轉(zhuǎn)錄水平也上調(diào)了3.5和4.3倍(P<0.01)，但基因dnaJ和groEL無明顯變化。通用應(yīng)激蛋白基因usp和熱休克蛋白基因hsp相對轉(zhuǎn)錄水平亦分別顯著上調(diào)6.6～8.6倍和3.8～4.9倍(P<0.05)，其可在極端惡劣環(huán)境時給予菌體一定的抗性來應(yīng)對環(huán)境傷害[22]。

膽鹽對NCU116的葡萄糖代謝過程也產(chǎn)生了較大的影響，糖酵解過程的關(guān)鍵限速酶6-磷酸果糖激酶基因pfk和果糖二磷酸醛縮酶基因fba受膽鹽脅迫誘導(dǎo)后基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，分別上調(diào)2.8～4.0倍和2.2～5.1倍，且隨著膽鹽質(zhì)量濃度的上升呈顯著上升趨勢(P<0.01)，這可能是由于擴散到胞內(nèi)的膽鹽對基因pfk和fba等的分子結(jié)構(gòu)造成了一定的破壞，為使糖酵解過程能順利進行，通過提高其基因的轉(zhuǎn)錄水平來適應(yīng)不利環(huán)境的傷害[20]。糖酵解途徑中的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因gapB的相對轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯，但磷酸甘油酸激酶基因pgk、丙酮酸激酶基因pyk和乳酸脫氫酶基因ldh三種基因的轉(zhuǎn)錄水平都有明顯下調(diào)，分別下調(diào)4.4～8.3倍、8.3～10倍和2.5～4.8倍(P<0.05)，表明葡萄糖代謝受到較大的抑制，糖酵解的終產(chǎn)物丙酮酸生成量減少，從而生成的乳酸含量也隨之減少(見2.3.2)。

擴散到胞內(nèi)的膽鹽還會導(dǎo)致DNA損傷，修復(fù)蛋白recA的增加可修復(fù)受損的DNA[23]，但在NCU116中，基因recA的轉(zhuǎn)錄水平并無明顯變化，重組修復(fù)蛋白基因recO的相對轉(zhuǎn)錄水平卻下調(diào)了2.6～4.4倍(P<0.05)。ATP依賴型DNA解旋酶UvrD1和recA可與修復(fù)蛋白UvrA協(xié)同作用，以降低核蛋白的損傷[24]，在NCU116中基因UvrD1受脅迫誘導(dǎo)，其轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)了3.7～5.7倍(P<0.05)?？赡苁荱vrD1的保護作用，降低了膽鹽對菌體DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程的不利影響，從而使得基因recA的轉(zhuǎn)錄水平變化不大，基因recO轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)的原因尚不明確。細(xì)胞分裂蛋白基因ftsZ受到膽鹽脅迫后基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)了9倍左右(P<0.01)，表明膽鹽脅迫影響了NCU116的生長代謝。同時轉(zhuǎn)錄延伸因子基因greA受到質(zhì)量濃度0.3 g/100 mL的膽鹽脅迫后基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)4.3倍，但在膽鹽質(zhì)量濃度高于0.3 g/100 mL時，基因greA轉(zhuǎn)錄水平下降的幅度卻有所減少，這可能是由于greA在應(yīng)激反應(yīng)中的潛在作用[25]，通過降低轉(zhuǎn)錄水平下降的趨勢來應(yīng)對脅迫。

在膽鹽脅迫條件下，NCU116可通過提高分子伴侶蛋白和通用應(yīng)激蛋白等應(yīng)激基因的轉(zhuǎn)錄水平，同時減緩自身生長代謝來降低膽鹽對其的不利影響(圖2)。

圖2 不同質(zhì)量濃度膽鹽脅迫下植物乳桿菌NCU116基因相對表達量變化Fig.2 Changes in the genes expression of L. plantarum NCU116 at different concentrations of bile salts*表示兩者之間差異顯著，P<0.05；**表示兩者之間差異極顯著，P<0.01

2.3 關(guān)鍵生理指標(biāo)的測定

2.3.1 菌體表面疏水性和自凝聚能力的測定

膽鹽對菌體細(xì)胞的損傷首先體現(xiàn)在對細(xì)胞表面特性的影響，表面疏水性與自凝聚集能力是衡量細(xì)胞表面特性的重要指標(biāo)，與益生菌的黏附能力呈正相關(guān)性[26]，而益生菌只有能夠在腸道黏附并定殖才能發(fā)揮其益生功能。通過檢測菌體表面疏水性與自凝聚能力可檢測膽鹽對菌體表面的損傷程度，結(jié)果如表2所示。與空白對照相比，植物乳桿菌NCU116受到膽鹽脅迫后菌體疏水性顯著下降(P<0.05)，這可能是由于菌體表面的多聚糖等物質(zhì)的流失導(dǎo)致[27]，但在高膽鹽濃度處理(>0.3 g/100 mL)的情況下，NCU116的菌體表面疏水性變化不大(P>0.05)。受表面疏水性影響，菌體間相互作用發(fā)生了變化，菌體的自凝聚能力受膽鹽脅迫后顯著下降(P<0.05)。菌懸液靜置2 h時，與空白對照相比，0.3 g/100 mL膽鹽脅迫后的NCU116的自凝聚能力下降了一半(P<0.05)，而在含0.5～1 g/100 mL膽鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NCU116自凝聚能力均為0。這可能是由于膽鹽同時具有親水性與親油性[28]，當(dāng)菌懸液中膽鹽質(zhì)量濃度較高，細(xì)菌表面殘留的部分膽鹽使菌體沉降速度變緩，靜置時間較短時，菌體幾乎未沉降，因此無法檢測此時的自凝聚能力。靜置4、6 h時自凝聚集能力變化仍不明顯，但此時NCU116的自凝聚能力在高質(zhì)量濃度膽鹽脅迫條件后下降趨勢減緩。沉降24 h后，菌體自凝聚能力從空白對照的75%下降至1 g/100 mL膽鹽處理下的51.7%(P<0.05)。

表2 膽鹽脅迫下植物乳桿菌NCU116表面疏水性及自凝聚能力的變化Table 2 Changes in surface hydrophobicity and self-aggregation ability of L. plantarum NCU116 under bile salt stress

注：同列不同字母表示差異性顯著(P<0.05)，下同。

2.3.2 胞內(nèi)葡萄糖和乳酸含量的測定

乳酸菌缺乏完整的檸檬酸循環(huán)，因此其生成ATP主要依靠糖酵解和氨基酸代謝[29-30]。檢測膽鹽脅迫后NCU116胞內(nèi)葡萄糖和乳酸含量，可表明膽鹽對糖代謝的抑制程度，結(jié)果如表3所示。當(dāng)用MRS培養(yǎng)植物乳桿菌NCU116時，培養(yǎng)基中的主要碳源葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑大量生成乳酸并釋放ATP，葡萄糖胞內(nèi)殘余量較少；膽鹽脅迫后葡萄糖代謝能力受到抑制，碳源利用率降低，胞內(nèi)葡萄糖含量由空白對照的24.9 μg/mL上升至0.3 g/100 mL膽鹽脅迫后的69.7 μg/mL,隨著膽鹽含量繼續(xù)增加，胞內(nèi)殘余葡萄糖含量顯著上升(P<0.05)，用0.5 g/100 mL含量膽鹽脅迫后，細(xì)菌胞內(nèi)葡萄糖含量繼續(xù)上升至289.7 μg/mL；同時，乳酸生成量因乳酸脫氫酶ldh和丙酮酸激酶pyk基因的表達量下調(diào)而大幅降低(P<0.05)，由空白對照的1 205.3 μg/mL下降至0.3 g/100 mL膽鹽脅迫后的789.2 μg/mL，膽鹽含量上升至0.5 g/100 mL時，細(xì)菌胞內(nèi)乳酸含量已下降至83.2 μg/mL。

作為MRS中的主要碳源，葡萄糖能顯著提高乳酸乳桿菌的膽鹽耐受力[31]，這可能是由于低分子量碳水化合物較高分子量碳水更容易被菌體吸收利用，且它們更易進入細(xì)胞膜的磷脂雙分子層[32]，對膜結(jié)構(gòu)提供一定的保護作用。因此在膽鹽脅迫導(dǎo)致代謝紊亂的同時，存在于胞內(nèi)和細(xì)胞膜中的葡萄糖又為植物乳桿菌NCU116提供保護作用，減輕了膽鹽的毒害。隨著膽鹽質(zhì)量濃度的繼續(xù)上升，葡萄糖殘余量上升與乳酸生成量降低的趨勢都有所減緩，不再出現(xiàn)大幅度的變動。表明植物乳桿菌NCU116有較好的耐受高質(zhì)量濃度膽鹽的能力(表3)。

表3 膽鹽脅迫下植物乳桿菌NCU116胞內(nèi)葡萄糖和乳酸含量的變化Table 3 Changes of intracellular glucose and lactic acidcontent in L. plantarum NCU116 under bile salt stress

2.3.3 胞內(nèi)氨基酸含量的測定

膽鹽脅迫除了對菌體表面和代謝產(chǎn)生不利影響，還會給菌體帶來一系列其他脅迫的損害，如活性氧/氮狀態(tài)導(dǎo)致的氧化脅迫、解離釋放H+引起的酸脅迫等[33]。氨基酸作為1種主要的氮源，可通過代謝產(chǎn)生能量供給細(xì)菌正常生殖代謝，還能產(chǎn)氨以調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH值以及提供營養(yǎng)成分的合成前體等，來應(yīng)對某些環(huán)境脅迫[29]。

在菌體受到外界影響的情況下，胞內(nèi)蘇氨酸可與丙酮酸經(jīng)酶催化生成纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，用于增強菌體細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[34]。在表4中，受到膽鹽脅迫后，胞內(nèi)蘇氨酸含量顯著降低(最高降低4.6 μg/mL，P<0.01)，同時纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸含量升高(P<0.05)，有助于NCU116維持穩(wěn)定的細(xì)胞膜；甘氨酸與谷氨酸是菌體的必須氨基酸，在缺少這2種必須氨基酸的情況下，菌體生長代謝將減緩甚至停滯[35]，NCU116受膽鹽脅迫后，這2種必須氨基酸的含量降低較少(僅降低約1～2 μg/mL)，有助于維持穩(wěn)定的生長代謝；同時，胞內(nèi)絲氨酸、酪氨酸受膽鹽脅迫后含量均顯著增加(P<0.01)，從外界吸收的絲氨酸可被優(yōu)先利用于合成其他必需氨基酸，如半胱氨酸等，以滿足細(xì)胞生殖代謝的需要，酪氨酸在細(xì)菌胞內(nèi)存在多種代謝通路，其代謝產(chǎn)物主要是蛋白質(zhì)、多巴胺等重要大分子物質(zhì)的前體物質(zhì)[34]，可在一定程度上有利于保持膽鹽脅迫導(dǎo)致的胞內(nèi)大分子物質(zhì)穩(wěn)定性；苯丙氨酸含量上升也較為明顯(P<0.01)，其可在胞內(nèi)產(chǎn)生多種中間代謝產(chǎn)物，如苯丙酮酸、2-羥基-3-苯基丙酸酯等，可直接進入糖酵解過程，以維持糖酵解過程的穩(wěn)定[34]。在所有胞內(nèi)游離氨基酸中含量最高的是精氨酸(高達10 μg/mL以上)，受到膽鹽脅迫后也有一定的上升，精氨酸可通過ADI途徑(精氨酸脫亞胺酶途徑)或精氨酸脫羧酶-尿素酶路轉(zhuǎn)化為氨以調(diào)控胞內(nèi)pH值，同時增加胞內(nèi)ATP濃度來應(yīng)對環(huán)境脅迫的傷害[36]。

在受到膽鹽脅迫后，植物乳桿菌NCU116可通過積累游離氨基酸來穩(wěn)定細(xì)胞膜，穩(wěn)定必須氨基酸的含量，并利用氨基酸的產(chǎn)能代謝以維持基本代謝，還可通過脫羧酶作用產(chǎn)氨以平衡胞內(nèi)pH值(表4)。

表4 膽鹽脅迫下植物乳桿菌NCU116胞內(nèi)氨基酸含量的變化Table 4 Changes of intracellular amino acid content of L. plantarum NCU116 under bile salt stress

注：*表示與對照組差異顯著，P<0.05；**表示與對照組差異極顯著，P<0.01。

3 結(jié)論

胃腸道環(huán)境中的膽鹽會對進入人體的乳酸菌帶來脅迫傷害，甚至?xí)芙饧?xì)胞膜導(dǎo)致乳酸菌死亡[15]。為使乳酸菌在胃腸道中較好地存活并發(fā)揮益生功能，近年來對乳酸菌的耐膽鹽機制研究越來越受到人們的關(guān)注[7]。本實驗分別用不同含量的膽鹽培養(yǎng)基處理植物乳桿菌NCU116，對其基因轉(zhuǎn)錄水平變化和關(guān)鍵生理指標(biāo)的檢測表明，NCU116受到膽鹽脅迫后細(xì)胞膜出現(xiàn)破損，菌體表面疏水性和自凝聚能力下降，葡萄糖代謝受一定程度的抑制，乳酸生成量減少。但隨著膽鹽含量的上升，NCU116受到的影響趨勢明顯減緩。同時，NCU116可通過調(diào)控應(yīng)激蛋白基因和修復(fù)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平來應(yīng)對膽鹽脅迫導(dǎo)致的蛋白質(zhì)過量、錯誤折疊和對轉(zhuǎn)錄、復(fù)制過程的不利影響，調(diào)控糖酵解關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平保證糖代謝的順利進行，積累胞內(nèi)氨基酸含量來穩(wěn)定細(xì)胞膜、調(diào)控胞內(nèi)pH值及產(chǎn)能維持代謝等，并通過降低自身生長代謝來緩解脅迫帶來的紊亂。在高膽鹽脅迫條件下，NCU116能保持較高的活菌數(shù)，表明植物乳桿菌NCU116有較好的耐高濃度膽鹽的能力，可在胃腸道發(fā)揮其益生功能。本研究初步探討了NCU116的耐膽鹽機制，但對給予NCU116膽鹽抗性的基因，其具體功能還未十分明確，以及基因RecO轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)的原因和基因greA應(yīng)對脅迫傷害的機理和功能等，都有待進一步的研究。