毛江川，王金晶，鄭飛云，劉春鳳，鈕成拓，李崎*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

啤酒老化是啤酒行業(yè)亟待解決的問題，不僅對(duì)啤酒風(fēng)味及風(fēng)味穩(wěn)定性產(chǎn)生嚴(yán)重的不利影響，還降低啤酒的新鮮度和縮短其貨架期。風(fēng)味穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)啤酒質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，其中SO2是啤酒中最有效的風(fēng)味穩(wěn)定劑和抗氧化劑之一，通過與H2O2反應(yīng)清除啤酒中的氧自由基，從而有效提高啤酒抗氧化能力[1-3]。乙醛是啤酒中含量最高的羰基化合物，與啤酒老化直接相關(guān)[4]，其形成過程與酵母的能量代謝密切相關(guān)。過高的乙醛含量給啤酒帶來生青味和腐爛蘋果味等不良風(fēng)味，同時(shí)影響啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性。

與硫代謝相關(guān)的蛋氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸對(duì)啤酒酵母產(chǎn)SO2存在一定的影響，而對(duì)乙醛產(chǎn)量的影響報(bào)道甚少。為探究啤酒酵母中總SO2和乙醛產(chǎn)量的影響因素及兩者產(chǎn)量之間的關(guān)系，本研究將這3種氨基酸添加于麥汁中，分析其對(duì)啤酒酵母總SO2和乙醛產(chǎn)量的變化情況，同時(shí)利用BiWort和BiGGY平板來定性分析3種氨基酸引起啤酒酵母SO2產(chǎn)量變化的原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出粉10，蛋白胨20，無(wú)水葡萄糖20，115 ℃下滅菌15 min。

BiGGY培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出粉1，甘氨酸10，無(wú)水葡萄糖20，Na2SO31，檸檬酸鉍銨1，瓊脂粉16，115 ℃下滅菌15 min。

麥汁培養(yǎng)基：12 °P自制麥汁，105 ℃下滅菌10 min。

BiWort培養(yǎng)基(g/L)：12 °P自制麥汁，檸檬酸鉍銨1，瓊脂粉16，105 ℃下滅菌10 min。

1.1.2 試劑

酵母浸出粉、蛋白胨、瓊脂粉，生工生物工程(上海)股份有限公司；無(wú)水葡萄糖、甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、亞硫酸鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸鉍銨、乙醛(色譜純)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；3-庚酮(色譜純)，Sigma-Aldrich公司；麥芽，中糧集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

阿貝折光儀，上海豫光儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)(UV-2000)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；高壓滅菌鍋(HVE-50)，日本Hirayama公司；自動(dòng)頂空進(jìn)樣氣相色譜儀(GC-2010)，日本島津(Shimadzu)公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(5804 R)，德國(guó)Eppendorf公司；生化培養(yǎng)箱(SPX-250)，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；生化培養(yǎng)箱(BSP-250)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

挑取一環(huán)啤酒酵母菌株于10 mL 12 °P麥汁試管中，28 ℃培養(yǎng)36 h后轉(zhuǎn)接1 mL菌液于9 mL 12 °P麥汁試管中，25 ℃培養(yǎng)36 h后轉(zhuǎn)接入70 mL 12 °P麥汁，23 ℃培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)接入300 mL 12 °P麥汁，接種量為1×107CFU/mL。搖勻后扣上發(fā)酵栓，用無(wú)菌水密封發(fā)酵栓后11 ℃發(fā)酵7 d。為研究蛋氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸對(duì)啤酒酵母總SO2和乙醛產(chǎn)量的影響，在麥汁中分別添加質(zhì)量濃度為100 mg/L和200 mg/L三種氨基酸。

1.3.2 鹽酸副玫瑰苯胺法測(cè)定發(fā)酵液中總SO2含量

參照文獻(xiàn)[19]中鹽酸副玫瑰苯胺法測(cè)定發(fā)酵液中總SO2含量。將發(fā)酵液在5 000×g離心5 min后取上清液，上清液中SO2與5%甲醛和鹽酸副玫瑰苯胺發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生紫色絡(luò)合物，在550 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光值，其總SO2的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.028 88x-0.007 23 (R2=0.999 2)。

1.3.3 頂空氣相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中乙醛含量

將發(fā)酵液離心后取上清，參照文獻(xiàn)[20]中方法進(jìn)行發(fā)酵液中乙醛的檢測(cè)。分別添加4 mL發(fā)酵液、1 mL 30 mg/L 3-庚酮內(nèi)標(biāo)和1.8 g NaCl于頂空瓶。檢測(cè)條件為：FID檢測(cè)器溫度為250 ℃；色譜柱由初始溫度40 ℃以10 ℃/min升至180 ℃。

1.3.4 比重瓶法測(cè)定發(fā)酵液中乙醇含量

取經(jīng)濾紙過濾后的發(fā)酵液100 mL，并加入50 mL去離子水于圓底燒瓶進(jìn)行蒸餾，將100 mL餾出物進(jìn)行比重瓶法測(cè)定，計(jì)算比值后查閱GB/T 4928—2008啤酒分析方法，其對(duì)應(yīng)值為發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)(φ)。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒酵母中總SO2和乙醛產(chǎn)量的關(guān)系

表1 典型啤酒酵母菌株中總SO2和乙醛產(chǎn)量Table 1 The production of total SO2 and acetaldehydein brewer’s yeasts

注：同一行不同字母代表顯著性差異(P<0.05)。

加黑代表啤酒酵母菌株中表達(dá)上調(diào)，淺色代表啤酒酵母菌株中表達(dá)下調(diào)圖1 啤酒酵母中含硫氨基酸和乙醛代謝圖Fig.1 Sulfur amino acid and acetaldehyde metabolism in brewer’s yeast

2.2 硫代謝關(guān)鍵氨基酸對(duì)啤酒酵母總SO2和乙醛產(chǎn)量的影響

2.2.1 外源蛋氨酸對(duì)啤酒酵母總SO2和乙醛產(chǎn)量的影響

表2 外源添加蛋氨酸對(duì)啤酒酵母產(chǎn)總SO2、乙醛和乙醇的影響Table 2 Effects of methionine on total SO2, acetaldehyde and ethanol production in brewer’s yeasts D-A-14 and

注：同一列不同字母代表顯著性差異(P<0.05)。

圖2 蛋氨酸對(duì)啤酒酵母D-A-14和中還原酶活性和S2-產(chǎn)量的作用Fig.2 Effects of methionine on sulfite reductase activityand sulfide production in brewer’s yeasts D-A-14 and

2.2.2 外源半胱氨酸對(duì)啤酒酵母總SO2和乙醛產(chǎn)量的影響

表3 外源添加半胱氨酸對(duì)啤酒酵母產(chǎn)總SO2、乙醛和乙醇的影響Table 3 Effects of cysteine on in total SO2, acetaldehyde and ethanol production in brewer’s yeasts D-A-14 and

注：同一列不同字母代表顯著性差異(P<0.05)。

圖3 半胱氨酸對(duì)啤酒酵母D-A-14和中還原酶活性和S2-產(chǎn)量的作用Fig.3 Effects of cysteine on sulfite reductase activity and sulfide production in brewer’s yeasts D-A-14 and

2.2.3 外源蘇氨酸對(duì)啤酒酵母總SO2和乙醛產(chǎn)量的影響

表4 外源添加蘇氨酸對(duì)啤酒酵母產(chǎn)總SO2、乙醛和乙醇的影響Table 4 Effects of threonine on total SO2, acetaldehyde and ethanol production in brewer’s yeasts D-A-14 and

注：同一列不同字母代表顯著性差異(P<0.05)。

圖4 蘇氨酸對(duì)啤酒酵母D-A-14和中還原酶活性和S2-產(chǎn)量的作用Fig.4 Effects of threonine on sulfite reductase activity and sulfide production in brewer’s yeasts D-A-14 and

2.3 啤酒酵母中總SO2和乙醛產(chǎn)量的相關(guān)性

圖5 啤酒酵母中添加3種氨基酸后總SO2和乙醛產(chǎn)量的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between total SO2 andacetaldehyde production by addition of three amino acids in brewer’s yeast

3 結(jié)論