金鐵峰

浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

糖尿病對肝臟的損害臨床最常見的表現(xiàn)為非酒精性脂肪肝病（NAFLD）。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）和叉頭轉(zhuǎn)錄因子（FoxO1）在NAFLD演變中起著重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1/FoxO1信號通路與改善機(jī)體胰島素敏感性、調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝、抗氧化應(yīng)激及抗炎等作用緊密相關(guān)。本研究擬用鏈脲佐菌素（STZ）造成的2型糖尿?。═2DM）模型大鼠研究白背三七總黃酮對SIRT1/FoxO1通路的干預(yù)作用，并探討白背三七總黃酮對糖尿病肝損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物及飼料：清潔級（SPF）雄性SD大鼠40只，體重180～220g，購自上海西普爾-必凱動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。常規(guī)飼料由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。高糖高脂飼料由1O.0%白砂糖、10.0%熟豬油、0.5%膽固醇、1O.0%蛋黃粉及69.5%基礎(chǔ)飼料組成，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院制作成型及烘焙而成。

1.2 藥物及試劑：白背三七，由浙江名中醫(yī)館提供。白背三七總黃酮（黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.3%）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心制備。鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司，批號B64927）?？筍1RT1抗體（Abcam公司）；抗FOXO1抗體（Santa Cruz公司）；抗Ac-FOXO1抗體（Santa Cruz公司）。

1.3 糖尿病模型復(fù)制：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取6只作為正常對照組，給予普通飼料喂養(yǎng)。其余大鼠作為實(shí)驗(yàn)組：高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，誘發(fā)胰島素抵抗。禁食10h后，將2%鏈脲佐菌素溶液按30mg/kg腹腔注射。72h后采用尾靜脈采血的方法測量血糖，持續(xù)3d的血糖濃度＞16.7mmol/L證明T2DM模型大鼠造模成功。

1.4 分組與給藥：將造模成功的24只大鼠隨機(jī)分為模型組、白背三七總黃酮低（30mg/kg）、中（60mg/kg）、高（120mg/kg）劑量組，每組6只。正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)給予高糖高脂飼料。各給藥組大鼠按每次lml/100g體質(zhì)量的容量灌胃給藥。正常對照組和模型組給等體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)8周。

1.5 標(biāo)本的采集：在用藥8周末，大鼠禁食不禁水12小時(shí)后稱重，以1.0mg/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟穿刺抽血，靜置30min后，以3000r/min離心10min，分離血清（用于檢測血糖、血脂、胰島素水平及肝功能指標(biāo)），-20℃保存。分離肝臟，取部分組織固定于10%中性甲醛溶液中以備光鏡觀察，再取部分肝臟快速液氮冷凍，用于SIRT1、FoxO1及乙酰化的FoxO1（Ac-FoxO1）蛋白含量的檢測。

1.6 血清生化指標(biāo)測定：采用全自動生化分析儀測定空腹血糖（FBG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、甘油三酯（TG）。

1.7 肝組織病理變化：肝臟組織常規(guī)固定脫水、透明、包埋、切片，行蘇木素一伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)改變。

1.8 Western-blot法檢測肝臟組織中Sirt1、FoxO1、Ac-FoxO1蛋白的表達(dá)：用二喹啉甲酸（BCA）比色法蛋白定量試劑盒檢測各組樣品蛋白濃度。在電泳加樣孔內(nèi)加入等量蛋白質(zhì)，10%Bis/Tris凝膠分離蛋白，并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用TBST（150mM NaC1，50mM Tris，0.1%Tween-20，pH 7.5）稀釋的5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2h，孵育抗SIRT1（1：500稀釋）、FOXO1（1：1000稀釋）、Ac-FOXO1（1：1000稀釋），4℃過夜；用TBST洗滌3次；室溫孵育對應(yīng)的二抗（1：5000稀釋）1.5h；用TBST洗滌3次。使用BioRad成像系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)條帶并使用Image Lab軟件定量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)。結(jié)果以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清生化指標(biāo)改變情況：見表1。

表1 白背三七總黃酮對DM大鼠FBG、ALT、AST和TG的影響（±s，n=6）

表1 白背三七總黃酮對DM大鼠FBG、ALT、AST和TG的影響（±s，n=6）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

TG（mmol/L）0.23±0.06 2.36±0.77*1.79±0.75#1.55±0.65#1.41±0.64#組別正常對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組FBG（mmol/L）5.16±1.08 25.12±6.13*25.24±5.99#25.03±4.61#24.20±3.78#ALT（U/L）50.35±6.66 173.55±89.57*121.75±43.97#111.30±30.15#109.75±14.45#AST（U/L）128.95±21.63 195.50±83.55*149.20±60.46#133.50±45.97#130.70±41.21#

2.2 各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)改變：根據(jù)HE染色顯示，正常對照組大鼠肝小葉輪廓清晰完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常；模型組大鼠肝細(xì)胞呈明顯脂肪變，局灶性壞死，壞死區(qū)和匯管區(qū)可見程度不一的炎癥細(xì)胞浸潤，部分細(xì)胞核變型和核偏位；白背三七總黃酮高、中、低劑量組肝細(xì)胞病變程度顯著輕于模型對照組，其中高劑量組最明顯。

2.3 各組大鼠肝臟組織SIRT1、FoxO1及Ac-FoxO1蛋白蛋白表達(dá)的變化：見表2、圖1。

表2 白背三七總黃酮對DM大鼠肝臟組織SIRT1/FoxO1通路的影響（±s，n=6）

表2 白背三七總黃酮對DM大鼠肝臟組織SIRT1/FoxO1通路的影響（±s，n=6）

Ac-FoxO1 0.22±0.07 0.65±0.10*0.51±0.05#0.34±0.11#0.28±0.12#組別正常對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組SIRT1 0.78±0.20 0.48±0.23*0.56±0.26#0.64±0.19#0.71±0.17#FoxO1 0.84±0.13 0.30±0.05*0.41±0.09#0.57±0.11#0.82±0.14#

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

圖1 Western blot法檢測SIRT1、FoxO1及Ac-FoxO1蛋白的表達(dá)

3 討論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制，主流觀點(diǎn)支持“多重打擊”學(xué)說[1］，第一重打擊主要是胰島素抵抗（IR），它可促使外周脂解增加和高胰島素血癥，引起肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯儲積，同時(shí)誘導(dǎo)脂肪變性的肝細(xì)胞對內(nèi)、外源性損害因素的敏感性提高，并為脂質(zhì)過氧化提供反應(yīng)基質(zhì)。第二重打擊主要是氧化應(yīng)激產(chǎn)生過多的活性氧自由基及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體功能障礙、促炎細(xì)胞因子生成，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥壞死?，F(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)某些基因也參與病情的進(jìn)展[2］。SIRT1是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；福c細(xì)胞衰老、壽命延長、抗氧化應(yīng)激和能量代謝調(diào)節(jié)等生命活動密切相關(guān)[3］。多項(xiàng)證據(jù)顯示，SIRT1能使Ac-FoxO1去乙?；?，激活FoxO1的轉(zhuǎn)錄活性，在脂質(zhì)代謝中起重要作用。SIRT1-FoxO1信號通路可能通過改善胰島素敏感性、減弱氧化應(yīng)激等多方面調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂肪代謝。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病并發(fā)癥的基本病機(jī)為瘀濁互阻，氣陰兩虛。消渴日久，治不得法，傷陰耗氣，痰瘀互結(jié)于肝絡(luò)可致糖尿病肝病?！吨腥A本草》記載白背三七可“清熱涼血，活血止痛，止血。主咳嗽，瘡瘍，燙炎傷，跌打損傷，風(fēng)濕痛，崩漏，外傷出血”，并被廣泛用于治療糖尿病。實(shí)驗(yàn)證實(shí)白背三七中黃酮類化合物含量豐富，且能顯著改善胰島的功能，用于治療2型糖尿病的功效確切。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)白背三七治療后血清FBG、TG、AST、ALT顯著降低；病理形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞形態(tài)多數(shù)恢復(fù)正常，脂肪變肝細(xì)胞、炎性細(xì)胞明顯減少；肝內(nèi)SIRT1、FoxO1蛋白表達(dá)明顯增加，Ac-FoxO1蛋白表達(dá)明顯減少，提示白背三七總黃酮可能通過激活SIRT1，使Ac-FoxO1去乙酰化，激活FoxO1的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而改善胰島素敏感性、減弱氧化應(yīng)激等，從而對糖尿病肝損傷起到了保護(hù)作用。