陳海燕， 孫志雙， 劉美含， 朱彩鳳， 施溯筠

( 延邊大學 藥學院， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

中國林蛙(Ranachensinensisdavid)又稱哈什蟆，屬兩棲綱無尾目蛙科蛙屬[1]，是集食補、藥用、美容等功能于一體的珍稀動物.目前，對林蛙的研究與應用主要集中于林蛙油和林蛙卵，而有關林蛙皮的則很少.研究[2]表明，林蛙皮中天然保濕因子透明質(zhì)酸、膠原蛋白等含量較高，同時對修復微創(chuàng)面、恢復皮膚屏障具有很好的效果[3].銀耳(Tremella)是銀耳科銀耳屬門擔子菌門真菌銀耳的子實體[4].銀耳多糖作為銀耳主要的活性成分之一，不僅具有優(yōu)良的保濕功效，而且可改善皮膚紋理度，降低皮膚粗糙度，增加皮膚彈性，可作為功效性成分應用于化妝品中[5].

在護膚市場中，保濕功效類護膚品一直深受消費者青睞.查閱文獻發(fā)現(xiàn)，有將林蛙皮或銀耳為原料制成護膚品的報道[2,4-7]，但未發(fā)現(xiàn)有將林蛙皮和銀耳共同作為原料制成護膚品的報道.鑒于此，本實驗以林蛙皮和銀耳多糖為主料，通過響應面分析法優(yōu)化保濕霜的基質(zhì)處方，并用皮膚角質(zhì)層的水分含量評價該處方的保濕效果.

1 實驗儀器與材料

UV-2201型紫外-可見分光光度計，日本島津公司； HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科技儀器有限公司； FA-2004電子天平，上海良平儀器儀表有限公司； Z-36HK高速臺式離心機，天津市醫(yī)療器械廠； pHSJ-4F雷磁型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司； ZK-2S真空干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司； DHG -9145A型電熱鼓風干燥箱，常州諾基儀器有限公司； SK-III數(shù)字皮膚水分測試儀，深圳凱爾電子有限公司； Laisen多功能活氧解毒機，廈門市萊森電子有限公司.

三乙醇胺，撫順佳化化工有限公司生產(chǎn)；甘油，益海嘉里投資有限公司生產(chǎn)；單硬脂酸甘油酯，廣州市佳力士食品有限公司生產(chǎn)；棕櫚酸異辛酯，山東優(yōu)索化工科技有限公司生產(chǎn)；卡波姆940，山東優(yōu)索化工科技有限公司生產(chǎn)；其他試劑均為分析純.

新鮮林蛙皮來自長白山輝煌生物科技有限公司，在-80 ℃冷凍備用；銀耳購于延吉市西市場.

2 實驗方法

2.1 林蛙皮及銀耳的加工處理

2.1.1林蛙皮極細粉的制備 將林蛙皮剪切成3 cm×2 cm的薄片.采用復合脫腥法[8](臭氧脫腥法[9]、β-環(huán)糊精法[10]和茶湯吸附法[9])對林蛙皮進行脫腥處理.采用H2O2法[11]脫色.將脫色后的林蛙皮置于真空干燥箱中干燥(80 ℃，3 h),然后粉碎過200目篩，得到林蛙皮極細粉.

2.1.2銀耳多糖的制備 將50 g銀耳子實體粉碎后過60目篩，加蒸餾水(料液比為1∶40)，在80 ℃水浴加熱提取3.5 h，冷卻后4 000 r/min離心10 min.將上清液濃縮至300 mL，用乙醇(體積比為1∶4)在4 ℃下沉淀12 h， 4 000 r/min離心10 min.除去上清液得到沉淀，取200 mL蒸餾水將其溶解，用Sevage法除去蛋白，得200 mL銀耳多糖提取液，備用.采用硫酸-苯酚法[12]測定銀耳多糖的含量.

2.2 林蛙皮銀耳保濕霜的配方

根據(jù)相關文獻[13]，結合預實驗初步確定保濕霜的基本配方如表1所示.

表1 林蛙皮銀耳保濕霜的配方

2.3 保濕霜的制備工藝

將卡波姆940用蒸餾水預先溶解，然后加入甘油，在45 ℃水浴中加熱攪拌直至甘油完全溶解.將B相水浴加熱至80 ℃溶解，攪拌條件下將A相加入B相并攪拌45 min以上；自然冷卻至45 ℃后，加入C相水浴恒溫(45 ℃)攪拌20～25 min，加入D相繼續(xù)攪拌至室溫，成霜體后裝瓶密封保存.

2.4 各項指標檢測

2.4.1外觀性狀 觀察樣品色澤是否均勻，有無明顯的麻點，是否細膩易涂抹.1～2分為色澤不均勻，有明顯顆粒感，不易涂抹； 3～4分為色澤不均勻，有顆粒感，不易涂抹； 5～6分為色澤較均勻，顆粒感不明顯，涂抹效果一般； 7～8分為色澤較均勻，顆粒感不明顯，涂抹效果良好； 9～10分為色澤均勻，無顆粒感，涂抹效果極佳.

2.4.2乳化穩(wěn)定性 取樣品0.1 g加入50 mL去離子水，50 ℃下攪拌均勻，冷卻至室溫；以水作參比，測定其在380～800 nm范圍內(nèi)的最低透光率.透光率越低表示乳化越穩(wěn)定.透光率為0.8～1，為0～2分；透光率為0.6～0.8，為2～4分；透光率為0.4～0.6，為4～6分；透光率為0.2～0.4，為6～8分；透光率為0～0.2，為8～10分.

2.5 單因素實驗

2.5.1單硬脂酸甘油酯添加量對膏劑制備的影響 在棕櫚酸異辛酯用量4%、三乙醇胺用量0.8%、甘油用量8%、乳化時間45 min條件下，以單硬脂酸甘油酯作為單因素，選取不同水平單硬脂酸甘油酯的用量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)進行實驗，以此確定單硬脂酸甘油酯的最佳用量.

2.5.2棕櫚酸異辛酯添加量對膏劑制備的影響 在單硬脂酸甘油酯用量3%、三乙醇胺用量0.8%、甘油用量8%、乳化時間45 min條件下，以棕櫚酸異辛酯作為單因素，選取不同水平棕櫚酸異辛酯的用量(2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%)進行實驗，以此確定棕櫚酸異辛酯的最佳用量.

2.5.3三乙醇胺添加量對膏劑制備的影響 在單硬脂酸甘油酯用量3%、棕櫚酸異辛酯用量4%、甘油用量8%、乳化時間45 min條件下，以三乙醇胺作為單因素，選取不同水平的三乙醇用量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)進行實驗，以此確定三乙醇胺的最佳用量.

2.5.4甘油添加量對膏劑制備的影響 在單硬脂酸甘油酯用量3%、棕櫚酸異辛酯用量4%、三乙醇胺用量0.8%、乳化時間45 min條件下，以甘油作為單因素，選取不同水平甘油的用量(2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%)進行實驗，以此確定甘油的最佳用量.

2.5.5林蛙皮極細粉和銀耳粗多糖提取液的添加量對膏劑制備的影響 參考文獻[14]選取不同林蛙皮極細粉的用量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)和銀耳粗多糖提取液的用量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)進行實驗，以此確定林蛙皮極細粉和銀耳粗多糖提取液的最佳用量.

2.6 響應面實驗

根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合試驗設計原理，選取單因素實驗中對保濕霜影響較大的3個因素(棕櫚酸異辛酯(A)、三乙醇胺(B)、甘油(C))作為自變量，并通過確定3個因素水平的最佳參數(shù)來進行響應面分析，因素及水平見表2.

表2 響應面分析因素及水平

2.7 皮膚角質(zhì)層水分含量的測試

按照自愿原則選擇20～30歲無皮膚病史及化妝品過敏史的10名受試者進行皮膚短期保濕性試驗.測試條件：環(huán)境溫度(25±1) ℃，相對濕度(40±5)%.測試前受試者需在測試條件下至少穩(wěn)定30 min，測試期間不能喝水和劇烈活動，不得使用其他同類產(chǎn)品.實驗過程中左右前臂(暴露狀態(tài))內(nèi)側(cè)標記(2 cm×2 cm)試驗區(qū)域，區(qū)域間隔1 cm.測試樣品和空白對照均隨機分布在左右前臂內(nèi)側(cè).樣品用量為(2.0±0.1) mg/cm2.使用皮膚水分測試儀測定標記點在樣品使用前和使用后每隔30 min皮膚角質(zhì)層的水分含量，直到180 min后停止測試，同時記錄所有的測試數(shù)據(jù)(單位為au.).

3 結果與分析

3.1 單因素實驗結果

林蛙皮銀耳保濕霜的單因素實驗結果如圖1所示.單硬脂酸甘油酯含量在1%～5%時，保濕霜色澤均勻，但用量過多或過少會使其乳化穩(wěn)定性變差，因此將3%的單硬脂酸甘油酯作為最佳用量.棕櫚酸異辛酯含量過少時保濕霜不易涂抹，含量過多則變得油膩，并且棕櫚酸異辛酯含量在4%和5%時的涂抹效果相差不大.因此考慮經(jīng)濟性選擇4%的棕櫚酸異辛酯作為最佳用量.三乙醇胺含量過多或過少均會降低保濕霜的穩(wěn)定性，因此選擇0.8%的三乙醇胺作為最佳用量.甘油含量過低保濕霜不易涂抹，含量過高則變得油膩，因此選擇8%的甘油作為最佳用量.

由圖1可知，林蛙皮極細粉和銀耳粗多糖提取液在質(zhì)量分數(shù)為1.0%～3.0%時均有明顯的保濕作用.和基質(zhì)共同作用時，林蛙皮極細粉含量為1.5%和銀耳粗多糖提取液含量為2%時所制得的保濕霜的涂抹分散性及穩(wěn)定性最好.

圖1 單因素實驗

3.2 響應面實驗結果

3.2.1響應面實驗設計 依次改變棕櫚酸異辛酯(A)、三乙醇胺(B)、甘油(C)的用量，以保濕霜的綜合評分作為指標，采用響應面分析法對工藝參數(shù)進行優(yōu)化.實驗設計和結果見表3.

表3 響應面實驗設計及結果

3.2.2擬合模型與顯著性檢驗 根據(jù)表3的數(shù)據(jù)，可得表4所示的回歸方程方差分析表.利用軟件Design-Expert 8.0.6進行非線性回歸的二次多項式擬合，得如下預測模型：

Y=9.35-0.91A-0.16B-0.1C-0.17AB-0.095AC-0.08BC-0.085A2-0.55B2-0.87C2，其中Y為保濕霜綜合評分.

表4 回歸方程模型方差分析表

注：P<0.05表示差異顯著；P<0.001表示差異極顯著.

由表4可知：棕櫚酸異辛酯的P<0.000 1，達到極顯著水平；三乙醇胺的P=0.057 6，甘油的P=0.192 0，均為統(tǒng)計顯著性.由此得出各因素對綜合評分的影響順序是：A(棕櫚酸異辛酯)>B(三乙醇胺)>C(甘油).根據(jù)回歸方程，二次項中AB、AC、BC3項的P值均大于0.05，說明因素之間的交互作用不顯著，各實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系.在二次項中A2、B2、C2的P值均小于0.001.依此配方，進行3次實驗，實驗所得綜合評分為9.19.

圖2—圖4為各因子交互作用的響應面分析圖和等高線分析圖.通過考察所擬合的響應曲面的形狀，可分析A、B、C的添加量對保濕霜綜合評價的影響.等高線的形狀趨于圓形表示2個因素之間交互作用不顯著，趨于橢圓形則相反.由圖2—圖4中的響應面的最高點和等高線可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，該極值點既是響應面的最高點，也是等高線最小橢圓的中心點.這說明，本文實驗因素所選擇的水平區(qū)間是合理的.

圖2 三乙醇胺和甘油相互影響的響應面分析圖(a)及等高線分析圖(b)

圖3 棕櫚酸異辛酯和甘油相互影響的響應面分析圖(a)及等高線分析圖(b)

圖4 棕櫚酸異辛酯和三乙醇胺相互影響的響應面分析圖(a)及等高線分析圖(b)

3.3 保濕霜的保濕效果

保濕霜保濕效果的測定結果如圖5所示.由圖5可以看出：A組在180 min內(nèi)皮膚角質(zhì)層的水分含量無顯著變化.B組在30 min內(nèi)時皮膚角質(zhì)層的水分含量最高，其原因可能是基質(zhì)中的成分阻斷了水分的流失；在30～90 min時，可能由于基質(zhì)內(nèi)的水分散失，水分含量降低；在90 min后無明顯變化.C組在30 min內(nèi)時皮膚角質(zhì)層的水分含量迅速升高；在60～90 min時水分含量平緩上升，且在90 min時水分含量最高；在90 min后隨時間的推移水分含量持續(xù)降低.D組在30～60 min時，皮膚角質(zhì)層的水分含量快速提高；在60～180 min時，水分含量增加緩慢.E組在0～90 min時，皮膚角質(zhì)層的水分含量有顯著提高，且在90 min達到最高值；在90～180 min時，水分含量高于同時間內(nèi)的C組和D組，有統(tǒng)計學差異(P<0.05).這說明，林蛙皮極細粉和銀耳粗多糖提取液在保濕效果上有協(xié)同增效作用.

圖5 林蛙皮銀耳保濕霜在180 min內(nèi)對皮膚角質(zhì)層水分含量的影響

4 結論

本文研究了棕櫚酸異辛酯、三乙醇胺、甘油等物質(zhì)的添加量對林蛙皮銀耳保濕霜綜合評分的影響，并通過單因素實驗、Box-Behnken中心組合設計原理和響應面分析法等確定了保濕霜的最佳基質(zhì)組成及各因素的主效應關系.實驗結果表明，林蛙皮銀耳保濕霜的最佳配方為：單硬脂酸甘油酯3%、棕櫚酸異辛酯4%、三乙醇胺0.8%、甘油8%、林蛙皮極細粉1.5%、銀耳粗多糖提取液2%，最佳配方的綜合評分為9.19.本文提出的保濕霜的制備方法簡單，條件溫和，且保濕霜具有良好的耐寒、耐熱性及穩(wěn)定性和舒適性，符合化妝品GB/T 29665—2013的要求，因此該保濕霜可作為一種良好的護膚品進行開發(fā)利用.