向 薇 方詩(shī)榮 譚 榮 張曉華 楊 華

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院呼吸內(nèi)科，恩施445000)

氣道上皮細(xì)胞除了防御吸入外源物質(zhì)及是病原微生物的物理屏障外，在獲得性免疫及固有免疫過程中也有重要作用。有研究表明，氣道上皮細(xì)胞可釋放出多種炎癥因子參與慢性阻塞性肺疾病、哮喘等慢性氣道疾病[1,2]。解整合素-金屬蛋白酶33(Adisintegrin and metallproteinase，ADAM33)基因定位于20號(hào)染色體短臂(20p13)，編碼的蛋白參與細(xì)胞黏附、蛋白分解、細(xì)胞融合及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，主要在肌纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)，在免疫細(xì)胞、支氣管細(xì)胞及炎癥細(xì)胞表面有很少表達(dá)，有多項(xiàng)研究表明，慢性哮喘、慢阻肺等氣道疾病中ADAM33的表達(dá)升高[3,4]，這提示ADAM33與氣道疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而ADAM33對(duì)支氣管上皮細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制研究尚未明確。氧化應(yīng)激與細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、分化及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等密切關(guān)系，也是導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂的一個(gè)主要機(jī)制，且可導(dǎo)致多種慢性氣道疾病的發(fā)生[5]。有研究表明，H2O2可抑制支氣管上皮細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)凋亡[6]。因此，本研究體外培養(yǎng)支氣管上皮細(xì)胞，旨在觀察ADAM33表達(dá)抑制對(duì)H2O2誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞活力、凋亡率、免疫因子表達(dá)及氧化損傷的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、FBS、青鏈霉素雙抗均購(gòu)自美國(guó)Gibco；CCK8試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；ADAM33、VEGF、COX-2、NF-κB p65和IKKα抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇凱基；DCFHDA、H2O2購(gòu)自美國(guó)Sigma；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞及培養(yǎng) 人支氣管上皮16HBE細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。細(xì)胞用10%FBS及1%青鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基輕柔混勻，于5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，次日換液，此后每2～3 d換液1次。細(xì)胞在瓶底長(zhǎng)滿90%左右的面積時(shí)進(jìn)行傳代或凍存。選擇3～10代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。在細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)前，用不加血清及雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞饑餓處理12～24 h，以使所有細(xì)胞能保持在一致的生長(zhǎng)水平。

1.2.2H2O2對(duì)16HBE細(xì)胞活力的影響 16HBE細(xì)胞以5×103個(gè)/孔均勻鋪在96孔板，加入25、50、100、200、400 μmol/L的H2O2，以未加H2O2處理(0 μmol/L H2O2)的16HBE細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，處理2 h后收集細(xì)胞，在每孔細(xì)胞中加入CCK8溶液，每孔加入10 μl，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，450 nm處酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值(A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 16HBE細(xì)胞分為對(duì)照組(細(xì)胞未經(jīng)特殊處理)、NC組(轉(zhuǎn)染不具有干擾作用的siRNA 24 h)、H2O2組(400 μmol/L的H2O2處理細(xì)胞2 h后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不具有干擾作用的siRNA 24 h)和H2O2+si-ADAM33組(400 μmol/L的H2O2處理細(xì)胞2 h后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶向抑制ADAM33的小干擾RNAs)。siRNA的設(shè)計(jì)及合成均由上海吉瑪完成。轉(zhuǎn)染以LipofectamineTM2000(Lipo2000，美國(guó)Invitrogen)為載體，參照轉(zhuǎn)染說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。制備siRNA-Lipo2000混合物。轉(zhuǎn)染前接種16HBE細(xì)胞于6孔板，細(xì)胞達(dá)30%～50%生長(zhǎng)密度時(shí)將siRNA-Lipo2000轉(zhuǎn)染至6孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染濃度為100 pmol/L，收集各處理組細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.4Western blot RIPA裂解液提取各處理至規(guī)定時(shí)間的細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后取等量上樣，每泳道加入50 μg，經(jīng)10%SDS-PAGE后隨即將樣品通過電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)好的膜放入5%脫脂奶粉中于37℃條件下封閉2 h，洗膜，加入一抗(1∶1 000稀釋的ADAM33、VEGF、COX-2、NF-κB p65和IKKα抗體)，4℃孵育過夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育2 h，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)蛋白含量，Quantity One對(duì)蛋白信號(hào)條帶進(jìn)行分析，Image J圖像處理與分析軟件具體量化蛋白信號(hào)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 收集各處理至規(guī)定時(shí)間的細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌及1×binding buffer重懸細(xì)胞后，分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，充分混勻，避光孵育15～20 min，再加入1×binding buffer 400 μl，在1 h內(nèi)上機(jī)，流式細(xì)胞儀對(duì)各組細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6ROS水平檢測(cè) 通過具有細(xì)胞膜滲透性的DCFH-DA熒光探針對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞中內(nèi)源性ROS水平進(jìn)行檢測(cè)。預(yù)冷的PBS洗滌及1×binding buffer重懸各處理至規(guī)定時(shí)間的細(xì)胞后，加入終濃度為10 μmol/L的含有DCFHDA的工作液于培養(yǎng)基中，避光37℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1H2O2對(duì)16HBE細(xì)胞活力的影響 25、50、100、200、400 μmol/L的H2O2處理16HBE細(xì)胞 2 h，CCK8法檢測(cè)各濃度H2O2對(duì)16HBE細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如表1所示，25 μmol/L和50 μmol/L的H2O2不影響16HBE細(xì)胞活力，而100～400 μmol/L的H2O2可明顯抑制16HBE細(xì)胞活力，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2ADAM33 siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞效果 ADAM33 siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞后，通過Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞ADAM33的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖1和表2所示，si-ADAM33組ADAM33 表達(dá)低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NC組ADAM33表達(dá)與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3ADAM33 siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞活力及凋亡率的影響 CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖2和表3所示，與NC組比較，H2O2組細(xì)胞活力降低，凋亡率升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與H2O2組比較，H2O2+si-ADAM33組細(xì)胞活力升高，凋亡率降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4ADAM33 siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞

表1 H2O2對(duì)16HBE細(xì)胞活力的影響

Tab.1 Effect of H2O2on activity of 16HBE cells

H2O2 concentrationCell viability(A value)0 μmol/L(Control)0.574±0.05225 μmol/L0.563±0.04750 μmol/L0.552±0.045100 μmol/L0.410±0.0411)200 μmol/L0.305±0.0321)400 μmol/L0.187±0.0231)F45.429P0.000

Note：1)P<0.05 vs 0 μmol/L(Control).

圖1 ADAM33 siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞ADAM33蛋白表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoresis of ADAM33 protein expression in 16HBE cells transfected with ADAM33 siRNA

表2 ADAM33 siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞ADAM33蛋白相對(duì)表達(dá)量

Tab.2 Relative expression of ADAM33 protein in 16HBE cells transfected with ADAM33 siRNA

GroupsRelative expression of ADAM33 proteinControl group0.496±0.055NC group0.478±0.051si-ADAM33 group0.089±0.0101)F83.119P0.000

Note：1)P<0.05 vs Control.

ROS水平的影響 以流式細(xì)胞儀檢測(cè)的各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度值衡量細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果如表4所示，H2O2組ROS水平高于NC組，而H2O2+si-ADAM33組ROS水平低于H2O2組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5ADAM33 siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞免疫抑制因子表達(dá)的影響 各組細(xì)胞中免疫抑制因子VEGF和COX-2的蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖3和表5所示，H2O2組VEGF和COX-2的蛋白表達(dá)顯著高于NC組(P<0.05)，而H2O2+si-ADAM33組VEGF和COX-2的蛋白表達(dá)顯著低于H2O2組(P<0.05)。

2.6ADAM33 siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞NF-κB信號(hào)的影響 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路NF-κB p65和IKKα的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4和表6所示，H2O2組NF-κB p65和IKKα的蛋白表達(dá)顯著高于NC組(P<0.05)，而H2O2+si-ADAM33組NF-κB p65和IKKα的蛋白表達(dá)顯著低于H2O2組(P<0.05)。

圖2 ADAM33 siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of ADAM33 siRNA on apoptosis in 16HBE cells induced by H2O2

表3 ADAM33 siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞活力、凋亡的影響

Tab.3 Effect of ADAM33 siRNA on cell viability and apoptosis in 16HBE cells induced by H2O2

GroupsA valueApoptosis rate(%)NC group0.589±0.0655.02±0.26H2O2 group0.202±0.0181)35.42±3.111)H2O2+si-ADAM33 group0.427±0.0462)12.87±1.342)F51.006194.310P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs NC group；2)P<0.05 vs H2O2group.

表4 ADAM33 siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞ROS水平的影響

Tab.4 Effect of ADAM33 siRNA on ROS level in 16HBE cells induced by H2O2

GroupsROS relative generation(%)NC group1H2O2 group2.65±0.181)H2O2+si-ADAM33 group1.42±0.112)F148.712P0.000

Note：1)P<0.05 vs NC group；2)P<0.05 vs H2O2group.

圖3 ADAM33 siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞VEGF和COX-2蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of ADAM33 siRNA on expression of VEGF and COX-2 protein in 16HBE cells induced by H2O2

表5 ADAM33 siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞VEGF和COX-2蛋白表達(dá)的影響

Tab.5Effect of ADAM33 siRNA on expression of VEGF and COX-2 protein in 16HBE cells induced by H2O2

GroupsVEGFCOX-2NC group0.136±0.0160.051±0.007H2O2 group0.708±0.0751)0.357±0.0431)H2O2+si-ADAM33 group0.202±0.0242)0.118±0.0132)F136.497112.660P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs NC group；2)P<0.05 vs H2O2group.

圖4 ADAM33 siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞NF-κB p65和IKKα表達(dá)的影響Fig.4 Effect of ADAM33 siRNA on expression of NF-κB p65 and IKKα in 16HBE cells induced by H2O2

表6 ADAM33 siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞NF-κB p65和IKKα表達(dá)的影響

Tab.6 Effect of ADAM33 siRNA on expression of NF-κB p65 and IKKα in 16HBE cells induced by H2O2

GroupsNF-κB p65IKKαNC group0.152±0.0170.105±0.012H2O2 group0.656±0.0681)0.247±0.0271)H2O2+si-ADAM33 group0.311±0.0342)0.148±0.0182)F98.44839.867P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs NC group；2)P<0.05 vs H2O2group.

3 討論

近些年的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡/抗凋亡等的失衡可引起肺正常功能及結(jié)構(gòu)的破壞[7,8]。氧化應(yīng)激參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、分化等各種生理病理過程，氧化-抗氧化失衡可引起多種氣道疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。氣道上皮細(xì)胞是病毒感染、空氣污染等環(huán)境刺激的第一道防御線，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致其損傷。有研究表明，H2O2參與多種氣道疾病的發(fā)生[6]。因此，本研究也使用H2O2建立支氣管損傷模型。ADAM是近些年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)細(xì)胞結(jié)合糖蛋白家族，其家族成員ADAM10、ADAM12和ADAM17均與氣道重塑及炎癥反應(yīng)存在密切關(guān)系[10-12]。ADAM33是ADAM家族中的一員，結(jié)構(gòu)域與該家族的其他成員類似，在除肝臟外的多種組織均有表達(dá)，目前在體外細(xì)胞系及動(dòng)物模型研究中發(fā)現(xiàn)，在腫瘤血管生成、哮喘大鼠模型及慢阻肺的肺組織等ADAM33出現(xiàn)過量表達(dá)[13,14]，這提示在氣道疾病中ADAM33發(fā)揮重要作用，而ADAM33對(duì)支氣管上皮細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制研究尚未明確。由于RNA干擾(RNAi)是一種新的用于基因表達(dá)阻斷的技術(shù)，且具有特異、高效對(duì)目的基因表達(dá)抑制的優(yōu)勢(shì)，在基因功能研究等方面應(yīng)用廣泛[15,16]。本研究通過RNAi技術(shù)抑制ADAM33表達(dá)，觀察ADAM33表達(dá)抑制對(duì)H2O2誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。結(jié)果顯示，抑制ADAM33可顯著減輕H2O2誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡。

ROS是一種有極強(qiáng)氧化作用的氧化劑，在正常情況下，ROS是人體正常代謝的產(chǎn)物，而大量的ROS在體內(nèi)產(chǎn)生可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞的凋亡或壞死。氣道上皮細(xì)胞中ROS可通過內(nèi)源性和外源性途徑暴露，且過氧化氫、香煙煙霧等多種因素可增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，引起細(xì)胞DNA斷裂、染色體損傷及細(xì)胞毒性[17,18]。本研究結(jié)果表明，ADAM33表達(dá)抑制可通過降低細(xì)胞ROS水平而減少氧化損傷。VEGF是一種重要的炎癥介質(zhì)之一，有研究表明，有促進(jìn)血管生成、炎癥細(xì)胞趨化、氣道重塑等功能，在哮喘等氣道炎癥疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中有重要作用[19,20]。COX-2為一種誘導(dǎo)型的異構(gòu)酶，主要在平滑肌細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞中存在，生理狀態(tài)下低表達(dá)，而在TNFα、IL-1β、LPS等因素刺激下，可參與氣道炎癥反應(yīng)[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB途徑的活化可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞VEGF、COX-2表達(dá)[22,23]。NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，與炎癥反應(yīng)、免疫細(xì)胞激活、細(xì)胞增殖和凋亡等相關(guān)，過度活化的NF-κB在腫瘤、炎癥反應(yīng)、免疫抑制、哮喘等疾病的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[24,25]。因此，NF-κB已成為開發(fā)新藥的一個(gè)重要靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，抑制ADAM33表達(dá)，可降低由H2O2誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞VEGF、COX-2及NF-κB信號(hào)通路NF-κB p65和IKKα表達(dá)的升高。這提示ADAM33對(duì)支氣管上皮細(xì)胞的影響與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，ADAM33基因表達(dá)抑制可降低由H2O2誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞凋亡、氧化損傷及免疫抑制，機(jī)制可能與下調(diào)NF-κB信號(hào)有關(guān)。該研究可能為ADAM33在氣道疾病中的作用研究奠定一定的基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步深入探究。