王宏英 魏海峰 王衛(wèi)芳 周曉晶 郭艷霞 米旭光 劉 磊 方艷秋

(長春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，長春130021)

腎癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，占腎臟原發(fā)惡性腫瘤的86%，占所有惡性腫瘤的1%～3%。近年來腎癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢。其主要治療方法為手術(shù)切除，但即使施行根治性手術(shù)，部分病例依舊會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1,2]。造成這一境況的主要原因是由于腎癌對放化療均不敏感，絕大多數(shù)腎癌患者出現(xiàn)對化療藥物的耐受，所以治療效果一直不理想，亟待尋找新的治療方案以改善這一境況。此外，由于腎臟位置隱蔽，早期腎癌大多沒有癥狀，或僅有部分腎腫瘤的腎外表現(xiàn)，臨床上往往出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時才被發(fā)現(xiàn)，延誤了治療時機，因此探尋新的腫瘤標(biāo)志物對腎癌的早期診斷、療效評價及預(yù)后評估等非常有臨床意義。氧化應(yīng)激是指反應(yīng)性氧化物增多而抗氧化能力減弱，并對機體造成傷害的現(xiàn)象。目前已知，多種疾病都與氧化應(yīng)激有關(guān)，但其與腎癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不明確[3]。此外，炎癥因子在惡性腫瘤中的過表達(dá)及其與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移、機體免疫功能調(diào)節(jié)之間的關(guān)系已成為研究的熱點[4,5]。因此，本研究對腎癌患者的手術(shù)病理標(biāo)本中的氧化應(yīng)激指標(biāo)8-OHdG及炎性反應(yīng)標(biāo)志物ICAM-1的表達(dá)進(jìn)行了檢測及相關(guān)研究，并探討這些指標(biāo)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，以期能進(jìn)一步探尋腎癌發(fā)生發(fā)展的機制，并為腎癌的早期診斷及預(yù)后評估等提供新的參考。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 收集2012年1月至2016年12月吉林省人民醫(yī)院行腎癌根治術(shù)的標(biāo)本，術(shù)后病理診斷證實為腎透明細(xì)胞癌，患者術(shù)前均未接受化療及放療或其他特殊治療，臨床資料完整。共收集腎癌標(biāo)本56例，其中左腎29例，右腎27例；所有患者隨訪至今或因腫瘤相關(guān)疾病引起死亡而終止。隨訪過程中共有7例患者失訪，因與腫瘤不相關(guān)原因死亡的患者3例，余46例獲隨訪，其中男性29例，女性17例，年齡36～75歲，中位年齡61.4歲；隨訪時間6～72個月，平均隨訪時間39.7個月；患者的其他資料詳見表1。

1.1.2試劑 ICAM-1和8-OHdG兔抗人多克隆抗體購自武漢華美生物，通用SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑購自武漢博士德。

1.2方法

1.2.1分組 將保存的腎癌石蠟標(biāo)本采用切片機制備腫瘤組織切片，并選取遠(yuǎn)離腫瘤，靠近切緣的腎組織部分制備切片，常規(guī)HE法確定制備的腎組織切片無癌細(xì)胞及炎細(xì)胞浸潤方為合格，作為正常腎組織對照(共18例)。免疫組織化學(xué)染色采用SP法進(jìn)行。一抗1∶100倍稀釋，二抗結(jié)合后加DAB顯色，蘇木素復(fù)染，以PBS代替一抗作為陰性對照。

表1 ICAM-1及8-OHdG表達(dá)與腎癌患者臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

Tab.1 Relationship between ICAM-1 and 8-OHdG expression and clinicopathological parameters in patients with renal cell carcinoma

VariablesnICAM-1[n(%)](-)(+)(++～+++)P value8-OHdG[n(%)](-)(+～+++)P valueAges(years)<60246(25.0%)5(20.8%)13(54.2%)0.19910(41.7%)14(58.3%)0.489≥60222(9.1%)9(40.9%)11(50.0%)7(31.8%)15(68.2%)GenderMale296(20.7%)8(27.6%)15(51.7%)0.4099(31.0%)20(69.0%)0.277Female172(11.8%)6(35.3%)9(52.9%)8(47.1%)9(52.9%)DifferentiationWell115(45.4%)3(27.3%)3(27.3%)0.0146(54.5%)5(45.5%)0.253Moderate203(15.0%)8(40.0%)9(45.0%)5(25.0%)15(75.0%)Poor150(0.0%)3(20.0%)12(80.0%)6(40.0%)9(60.0%)Tumor size≤5 cm286(21.4%)10(35.7%)12(42.9%)0.12614(50.0%)14(50.0%)0.022>5 cm182(11.1%)4(22.2%)12(66.7%)3(16.7%)15(83.3%)TNM stageⅠ-Ⅱ296(20.7%)11(37.9%)12(41.4%)0.16412(41.4%)17(58.6%)0.417Ⅲ-Ⅳ172(11.8%)3(17.6%)12(70.6%)5(29.4%)12(70.6%)Lyph node metastasisYes313(9.7%)9(29.0%)19(61.3%)0.0366(19.4%)25(80.6%)0.001No155(33.3%)5(33.3%)5(33.3%)11(73.3%)4(26.7%)Distant metastasisYes211(4.8%)3(14.3%)17(80.9%)0.0014(19.0%)17(81.0%)0.045No257(28.0%)11(44.0%)7(28.0%)13(52.0%)12(48.0%)PFS>3 years303(10.0%)10(33.3%)17(56.7%)0.19415(50.0%)15(50.0%)0.012≤3 years165(31.2%)4(25.0%)7(43.8%)2(12.5%)14(87.5%)

表2 ICAM-1及8-OHdG在正常腎組織及腎癌組織中的表達(dá)差異

Tab.2 Differential expression of ICAM-1 and 8-OHdG in normal renal tissue and renal cell carcinoma

GroupnICAM-1 expression[n(%)](-)(+)(++～+++)P8-OHdG expression[n(%)](-)(+～+++)PNormal renal tissue1813(72.2%)5(27.8%)0(0.0%)χ2=21.2816(88.9%)2(11.1%)χ2=11.97Renal carcinoma468(17.4%)14(30.4%)24(52.2%)0.000 017(37.0%)29(63.0%)0.000 5

1.2.2免疫組化染色結(jié)果判讀 依據(jù)低倍鏡下組織陽性染色強度及高倍鏡下陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行綜合評分。①染色強度：無染色計0分，淺黃色計1分，黃色計2分，棕褐色計3分。②染色百分比：<5%計0分，0%～25%計1分，25%～50%計2分，>50%計3分；以①+②計算最終得分，即陰性-(0分)、弱陽性+(1～2分)、中等陽性++(3～4分)、強陽性+++(5～6分)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗分析，小樣本資料用校正的χ2檢驗或Fisher′s確切概率法檢驗，以P<0.05或P<0.01為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ICAM-1及8-OHdG表達(dá)與腎癌患者臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系 統(tǒng)計分析結(jié)果表明：ICAM-1的表達(dá)變化與患者的性別、年齡、腫瘤大小及臨床分期無明確相關(guān)性(P>0.05)，但與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性，腫瘤分化程度越低，ICAM-1的陽性表達(dá)越強，且出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)要顯著高于未轉(zhuǎn)移的，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；而8-OHdG表達(dá)與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性(P<0.05或P<0.01)。所有隨訪病例中共有16例患者于三年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，三年無瘤生存率為65.2%，ICAM-1與腎癌患者的無進(jìn)展生存期(PFS)之間無顯著相關(guān)性(P>0.05)，而PFS≤3年的腎癌患者中，癌組織中8-OHdG呈陰性表達(dá)者2例(占比12.5%)，陽性表達(dá)者14例(占比87.5%)，與PFS>3年的患者相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。具體結(jié)果見表1。

2.2ICAM-1及8-OHdG在正常腎組織及腎癌組織中的表達(dá) ICAM-1在正常腎組織中的表達(dá)多為弱陽性或陰性表達(dá)，陽性者在腎小球、腎近曲小管、遠(yuǎn)曲小管及集合管等組織中均有表達(dá)。ICAM-1在腎癌中的表達(dá)為細(xì)胞膜及細(xì)胞漿著色，腫瘤間結(jié)締組織染色呈陰性。在46例腎癌組織中，38例呈ICAM-1染色陽性(占比82.6%)，其中(+++)8例，(++)16例，弱陽性(+)14例；絕大多數(shù)正常腎組織中8-OHdG呈陰性表達(dá)，腎癌組織中8-OHdG為細(xì)胞核及細(xì)胞漿內(nèi)染色。在46例腎癌組織中，29例呈8-OHdG染色陽性(占比63%)，其中(+++)3例，(++)14例，弱陽性(+)12例。ICAM-1及8-OHdG在正常腎組織及腎癌組織中的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果見表2。

3 討論

ICAM-1(Intercellular cell adhesion molecule-1 即細(xì)胞間黏附分子-1)屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族(IGSF)中的成員，是介導(dǎo)黏附反應(yīng)的一個重要黏附分子，參與細(xì)胞間的識別、細(xì)胞的活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞的伸展與移動，在控制腫瘤惡化和轉(zhuǎn)移以及調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)中起著重要作用[6,7]。有研究表明，ICAM-1在肝細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于對照組(80.00% vs 25.00%)，且侵襲性肝癌患者的肝癌組織中ICAM-1表達(dá)陽性率顯著高于非侵襲肝癌患者(92.31% vs 70.59%，P<0.05)，提示 ICAM-1是肝細(xì)胞癌進(jìn)展和侵襲的重要作用因子[8]。ICAM-1在宮頸癌中的表達(dá)明顯高于正常宮頸組織，且與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系緊密[9]。Li等[10]在進(jìn)行miR-335調(diào)節(jié)甲狀腺癌細(xì)胞生長機制的研究過程中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TC-133甲狀腺癌細(xì)胞中，ICAM-1表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)miR-335-5p可靶向ICAM-1并抑制其表達(dá)，從而抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖。但是對于腫瘤組織中ICAM-1的表達(dá)存在不同觀點：一方面癌細(xì)胞與單核細(xì)胞、浸潤的淋巴細(xì)胞的黏附可以削弱癌細(xì)胞與癌細(xì)胞之間的黏附，促發(fā)癌細(xì)胞隨淋巴細(xì)胞的遷移脫落母瘤，從而引起擴散發(fā)生轉(zhuǎn)移；另一方面，癌細(xì)胞膜上的細(xì)胞間黏附分子1與LFA-1結(jié)合后，可為T細(xì)胞活化提供一種共刺激信號，促進(jìn)免疫系統(tǒng)對癌細(xì)胞的殺傷[11,12]。但是大多數(shù)情況下，LFA-1-ICAM-1相互作用中斷，ICAM-1介導(dǎo)的同種T淋巴細(xì)胞聚集可能是腫瘤介導(dǎo)的免疫保留機制，在腫瘤微環(huán)境中抑制激活的CD8+T細(xì)胞。調(diào)節(jié)T細(xì)胞黏附可用于改善活化淋巴細(xì)胞向淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及其隨后的再循環(huán)[13]。關(guān)于腎癌組織中ICAM-1表達(dá)的研究并不多，本研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在正常腎組織中的表達(dá)多為弱陽性或陰性表達(dá)，而在腎癌組織中ICAM-1陽性表達(dá)增加，且與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性。推測其機制可能為分化差的腫瘤細(xì)胞ICAM-1表達(dá)增多，從腫瘤細(xì)胞表面脫落進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)成為可溶性分子后，可協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃逸細(xì)胞毒T細(xì)胞和NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視殺傷效應(yīng)，促使腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移?；谄渌[瘤的相關(guān)研究結(jié)果[14,15]，推測腎癌患者血清中ICAM-1的檢測同樣具有一定的臨床意義，需要進(jìn)一步去驗證。

ROS是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇。ROS 可雙向調(diào)控某些腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖，表現(xiàn)在低濃度的自由基能夠影響一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。機體內(nèi)的自由基通過其濃度調(diào)節(jié)著機體細(xì)胞的生死平衡，除了引起細(xì)胞凋亡、壞死的功能，低濃度的ROS 更廣泛的生理意義在于其對轉(zhuǎn)錄因子的激活以及對細(xì)胞增殖、分化的促進(jìn)。而高濃度ROS則可導(dǎo)致DNA、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)的氧化損傷，長期反復(fù)的氧化損傷導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。在臨床中，ROS水平在慢性白血病、乳腺癌、肺癌以及胃癌等惡性腫瘤中明顯升高[16-18]。正常機體狀態(tài)下，氧化還原態(tài)的失衡即氧化應(yīng)激態(tài)可以造成DNA的損傷，使抑癌基因失去活性及原癌基因活性增強，從而促進(jìn)細(xì)胞癌變，而DNA氧化損傷，生成大量嘌呤及嘧啶羥基化產(chǎn)物，8-OHdG是活性氧自由基如羥自由基、單線態(tài)氧等攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性加合物，8-OHdG目前已成為DNA氧化損傷中最常用的生物標(biāo)志物，故本實驗通過檢測各組病變組織中8-OHdG表達(dá)情況，以判斷患者疾病狀態(tài)。研究結(jié)果表明：8-OHdG表達(dá)與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性(P<0.05或P<0.01)。正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡中，當(dāng)身體處于過度氧負(fù)荷下，活性氧自由基形成過多，或抗氧化物質(zhì)活性下降，甚至衰竭，就會造成平衡破壞，氧化應(yīng)激引起細(xì)胞DNA損傷及錯誤修復(fù)，可導(dǎo)致癌基因的激活或抑癌基因的失活，從而引發(fā)癌癥啟動。本研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激水平與腫瘤大小具有顯著相關(guān)性，推測機制可能為氧化應(yīng)激通過影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，使癌細(xì)胞喪失正常的接觸抑制而不斷增殖。有研究表明，氧化應(yīng)激還能促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，進(jìn)而促進(jìn)癌塊的生長和轉(zhuǎn)移[19]。本研究發(fā)現(xiàn)8-OHdG的表達(dá)與腎癌患者的無進(jìn)展生存期(PFS)之間具有顯著相關(guān)性(P<0.05)，PFS≤3年的腎癌患者8-OHdG表達(dá)顯著高于PFS>3年的患者，提示腎癌患者機體氧化應(yīng)激水平是關(guān)乎腎癌預(yù)后的重要因素。

綜上，ICAM-1的表達(dá)及氧化應(yīng)激因素在腎癌的進(jìn)展中可能發(fā)揮著重要作用，具體機制尚需進(jìn)一步研究加以明確。隨著研究的不斷深入，未來通過干預(yù)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)或利用抗氧化劑捕獲氧自由基，消除或減輕氧化應(yīng)激，可能成為預(yù)防和阻斷腎癌發(fā)生發(fā)展的有效方法。