鄧茗月，葉翆紅，鄒文生，李衛(wèi)華

(1.安徽建筑大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.安徽建筑大學(xué) 材料與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230601)

0 引言

肝素鈉是帶負(fù)電荷最多、由三磺酸二糖重復(fù)單元組成的線性多糖，主要用作抗凝劑[1]。過量的肝素鈉會誘導(dǎo)大出血和血小板減少[2]，因此，對肝素鈉的檢測顯得十分必要。迄今，發(fā)展簡單、可靠的生物流體中肝素鈉檢測方法已經(jīng)引起了相當(dāng)大的關(guān)注[3-6]。除了傳統(tǒng)的激活凝血時間法與活化凝結(jié)時間法等，由于具有操作方便與成本低廉的優(yōu)勢，光學(xué)傳感器包括熒光法[7-9]、光散射法[10-12]和比色法[2，8-9]，目前已得到很大發(fā)展。這些傳感器的設(shè)計原理均基于帶正電的有機染料與帶負(fù)電的肝素鈉之間的靜電作用[7-13]。南開大學(xué)的王荷芳教授[14]發(fā)展了一種聚乙烯亞胺包裹的Mn摻雜ZnS量子點(Mn-ZnS QDs)檢測肝素鈉技術(shù)，由于肝素鈉荷負(fù)電引起了荷正點的Mn-ZnS QDs的點間聚集，肝素鈉負(fù)電荷產(chǎn)生的電場誘導(dǎo)了Mn-ZnS QDs的RTP增強，根據(jù)RTP的強度變化與肝素鈉濃度的關(guān)系，達(dá)到了檢測肝素鈉的目的。由于磷光的長發(fā)射壽命能夠很容易地避免體系的自熒光與散射光[15]，在很多摻雜半導(dǎo)體體系中研究了主體半導(dǎo)體與摻雜劑的室溫磷光(Room-temperature phosphorescence，RTP)[16-21]。Mn-ZnS QDs用作室溫磷光探針，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于傳感與分析領(lǐng)域[22-25]。

本文報道了一種基于Mn-ZnS QDs的RTP方法檢測肝素鈉。合成了荷正電的八胺丙基寡聚硅(OA-POSS)與荷負(fù)電的半胱氨酸包裹的Mn-ZnS QDs。當(dāng)OA-POSS加入到半胱氨酸包裹的Mn-ZnS QDs的溶液中，由于靜電作用使Mn-ZnS QDs發(fā)生點間聚集，形成OA-POSS與Mn-ZnS QDs聚集復(fù)合物，OA-POSS的電場誘導(dǎo)了RTP的增強。當(dāng)荷更高負(fù)電的肝素鈉加入到上述體系中，由于肝素鈉與OA-POSS間更強的靜電作用，使OA-POSS從聚集復(fù)合物中剝離，形成新的OA-POSS與肝素鈉聚集復(fù)合物，舊的聚集復(fù)合物的破壞使Mn-ZnS QDs的RTP逐漸衰減，這種衰減的RTP信號被用來檢測肝素鈉。衰減的RTP強度(ΔP)和肝素鈉濃度在2.5 μM到70 μM范圍內(nèi)存在著很好的線性相關(guān)關(guān)系(R=0.991)，檢測限為2.0 μM。重要的是，Mn-ZnS QDs應(yīng)用于環(huán)境流體中肝素鈉的檢測，有效消除了背景熒光與散射光的干擾，且作為肝素鈉的傳感平臺具有很好的應(yīng)用前景。

與Mn-ZnS QDs荷相反電荷的物質(zhì)能夠誘導(dǎo)Mn-ZnS QDs靜電組裝，從而縮短QDs間距離并形成更大的粒子，依次導(dǎo)致了下面三個結(jié)果:(1)單個Mn-ZnS QDs上的缺陷可以被臨近QDs修復(fù)；(2)由于組裝提的形成，相當(dāng)于QDs表面的Mn2+分布重排到內(nèi)部，導(dǎo)致更高的Mn2+發(fā)射[26]；(3)QDs周圍增強的定域電場增加了QDs間的庫侖作用，能夠更有效地誘導(dǎo)QDs的激發(fā)[14，27]。上述的每一個方面都有助于Mn-ZnS QDs發(fā)射的增強。每個OA-POSS分子帶八個正電荷，而先前工作中合成的半胱氨酸包裹的Mn-ZnS QDs帶負(fù)電(約-32mV)[28]，那么可以設(shè)想:當(dāng)OA-POSS與半胱氨酸包裹的Mn-ZnS QDs發(fā)生靜電自組裝，由于靜電作用使Mn-ZnS QDs發(fā)生點間聚集，就會產(chǎn)生上述三種作用，從而誘導(dǎo)Mn-ZnS QDs的RTP的增強。此外，當(dāng)荷更高負(fù)電的肝素鈉(約-60mV)加入到上述體系中，發(fā)生三組分競爭，由于肝素鈉與OAPOSS間更強的靜電作用，剝離促使Mn-ZnS QDs發(fā)生聚集的OA-POSS，形成新的OA-POSS與肝素鈉聚集復(fù)合物，使Mn-ZnS QDs增強的RTP逐漸衰減，這種衰減的RTP信號可用來檢測肝素鈉，見下圖1。為了證明上述設(shè)想的科學(xué)性，我們就Mn-ZnS QDs與OA-POSS間的作用，以及由此產(chǎn)生的光譜信號變化進行了研究。

1 實驗部分

1.1 材料

氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、半胱氨酸和肝素鈉均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。ZnSO4·7H2O、MnCl2·2H2O 和 Na2S·9H2O 等購自國藥集團。其它試劑均為分析試劑級。實驗用水均為超純水。

圖1 結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 儀器

分別用F-4600(日立，日本東京)和日立紫外UV-2910紫外-可見分光光度計記錄熒光光譜和紫外-可見吸收光譜。在Nicolet-6700分光光度計(Nicolet，Madison，WI，USA)上，用 KBR 窗口測量了傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)。在JEL-200CX(JEOL，日本東京)顯微鏡上對透射電子顯微鏡(TEM)進行了表征，加速電壓200 kV。利用Al Ka X射線源(1486.6eV)用XPS儀器(美國熱ESCALAB 250)進行了X射線光電子能譜(XPS)測試。在島津XRD-6000型衍射儀上，用Cu KA射線衍射儀測定了粉末X射線衍射譜。酸度用SartoriusPB-10 pH 計測定(Sartorius，Diatekon，瑞士)。以氫燈為光源，365 nm為激發(fā)波長，在愛丁堡譜儀F 900上記錄了熒光壽命的測量結(jié)果。

1.3 Mn-ZnS QDs的合成

量取 5.0 mL ZnSO4·7H2O(0.1 M)和 30 mg 半胱氨酸于燒杯中，用超純水溶解并稀釋到50 mL，將體系的pH調(diào)整為11.0，將溶液轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中攪拌 20 min后，注入 1.5 mL MnCl2·2H2O(0.01M)，30 min 后注入 5 mL Na2S(0.1M)，繼續(xù)攪拌30 min，上述過程全程充氮除氧。將溶液加熱到50°C，在有氧環(huán)境下陳化2 h后，自然冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入2倍體積乙醇后靜置1天，3000轉(zhuǎn)速下離心10 min，將得到的沉淀儲存于4°C冰箱中備用。

1.4 OA-POSS的合成

在典型的合成中，氨丙基三乙氧基硅烷作為溶膠-凝膠法的先驅(qū)被使用。取20 mL氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和160 mL甲醇于燒杯中，攪拌混合。在混合后的混合物中加入27 mL 0.1M的鹽酸，混合液攪拌一個星期直至OA-POSS白色粉末沉淀物出現(xiàn)，該沉淀即為OA-POSS。

1.5 樣品分析

實驗用水樣取自合肥污水廠，水樣通過0.45 μM微孔濾膜過濾，并將pH調(diào)整為7.4，儲存于4℃的冰箱中備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 Mn-ZnSQDs與OA-POSS間的自組裝

量子點是最具吸引力的納米粒子之一，與有機染料相比有著很多優(yōu)勢，比如可調(diào)發(fā)射和高量子產(chǎn)率等。Mn-ZnS QDs近年來被用作為室溫磷光探針[22-25]。這種類型的量子點可以通過靜電組裝形成聚集體而增強RTP發(fā)射，還可以有效避免散射光和自熒光。OA-POSS分子是八個APTES聚合的，八個角上的胺基容易結(jié)合質(zhì)子，形成荷八個正電荷的寡聚硅。兩種荷相反電荷的材料在同一體系中容易發(fā)生靜電自組裝作用。量子點的ζ電位被檢測為6.42mV，量子點帶正電荷，表明此測試方法是基于OA-POSS和半胱氨酸包裹的Mn-ZnS QDs之間的靜電作用[29]。

如圖2所示，Mn-ZnS QDs和OA-POSS形成的納米復(fù)合物的RTP光譜展示了此QDs的發(fā)射峰位于576 nm處。對于50 mg/L的Mn-ZnS QDs溶液中，隨著加入的OA-POSS的濃度從0逐漸增加時，QDs的RTP發(fā)射強度隨之增強。當(dāng)加入的OA-POSS的濃度為75 μM時，RTP強度達(dá)到最大值，而后隨著OA-POSS的繼續(xù)加入，RTP開始衰減。此外，QDs和OA-POSS形成的納米復(fù)合物的磷光強度在pH為7.0時能夠保持穩(wěn)定，且可以維持80 min以上，表明了此納米復(fù)合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

利用UV-vis光譜研究了不同組分間的相互作用。如圖2b所示，檢測了OA-POSS(曲線1)、肝素鈉(曲線 2)和 Mn-ZnS QDs(曲線 3)從 200到 500 nm的吸收光譜。當(dāng)OA-POSS加入到QDs的溶液中，導(dǎo)致了QDs的吸光度的增強(曲線4)。QDs和OA-POSS形成的納米粒子溶液中加入肝素鈉會致使其吸收度的增大(曲線5)。如圖2c所示，肝素鈉的吸光度隨著加入的OA-POSS濃度的增大而增強，這是由于肝素鈉與OA-POSS之間形成了緊湊的光散射粒子。同樣地，隨著加入的肝素鈉濃度的增強，QDs和OA-POSS形成的納米復(fù)合物的吸光度也隨之增大(見圖2d)。上述現(xiàn)象表明了QDs與OA-POSS之間發(fā)生了相互作用，且肝素鈉與QDs和OA-POSS形成的納米復(fù)合物之間也存在著相互作用。透射電鏡成像亦用于研究OA-POSS與Mn-ZnS QDs之間以及OA-POSS與肝素鈉之間的相互作用。如圖3(a)所示，OA-POSS加入到Mn-ZnS QDs溶液中，由于荷相反電荷，兩者間通過靜電自組裝成納米復(fù)合物。同樣地，將OA-POSS加入到肝素鈉溶液中，也會形成納米復(fù)合物，如圖3(b)。

圖2 RTP及UV-vis光譜圖

2.2 肝素鈉滴定OA-POSS與Mn-ZnS QDs納米復(fù)合物的RTP光譜

肝素鈉可以誘導(dǎo)PEI包裹的Mn-ZnS QDs之間的發(fā)生靜電聚集而縮短點間距離，促使QDs間形成更大的粒子[14]。為了證實Mn-ZnS QDs與OA-POSS之間形成的納米復(fù)合物探測肝素鈉的可能性，我們研究了肝素鈉對納米復(fù)合物的RTP的影響。如圖4所示，QDs與OA-POSS形成的納米復(fù)合物的增強的RTP隨著肝素鈉的加入而逐漸衰減，表明QDs與OA-POSS形成的納米復(fù)合物與肝素鈉之間存在著相互作用，這可能是由于肝素鈉的荷電更負(fù)，奪取了QDs與OA-POSS納米復(fù)合物中的OA-POSS，導(dǎo)致了納米復(fù)合物的解組裝，電場破壞以后，由電場引起的RTP增強隨之衰減，并接近原始強度。反之，當(dāng)肝素鈉加入到Mn-ZnS QDs溶液中(不存在OA-POSS)中，QDs的磷光發(fā)射強度幾乎沒有改變，這是由于兩者荷負(fù)電引起的。以上的光譜變化表明QDs與OA-POSS形成的納米復(fù)合物的RTP發(fā)射強度的衰減起因于OA-POSS和肝素鈉之間的相互作用。也研究了肝素鈉滴定前后的Mn-ZnS QDs的壽命變化，6.3毫秒左右的壽命符合靜態(tài)猝滅規(guī)律，說明了靜電作用的存在。

圖3 透射電鏡(TEM)成像圖

2.3 肝素鈉的RTP檢測和條件優(yōu)化

Mn-ZnS QDs與OA-POSS形成的納米復(fù)合物的在576 nm處的RTP發(fā)射用于肝素鈉的檢測，目的在于評估此納米復(fù)合物的肝素鈉定量的潛在可行性。如圖5所示，猝滅的磷光強度(ΔP)和肝素鈉濃度在2.5到70 μM范圍內(nèi)存在著很好的線性相關(guān)關(guān)系(R=0.991)，檢測限為2.0 μM，且5次測量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.9%。

考察了作用時間對光譜測量的影響，如圖6所示，上述的RTP強度的衰減受反應(yīng)時間的影響。對于不同的肝素鈉的加入量，QDs與OA-POSS形成的納米復(fù)合物與肝素鈉之間的競爭相互作用在經(jīng)過了大約40 min后保持持穩(wěn)定。因此，本研究選擇40 min作為實驗的反應(yīng)時間。

圖4 滴定RTP光譜圖

圖5 使用Mn-ZnSQDs與OA-POSS納米復(fù)合物作RTP探針的肝素鈉檢測校正曲線

圖6 不同肝素鈉濃度滴定Mn-ZnSQDs與OA-POSS納米復(fù)合物的時間依賴性RTP光譜

2.4 基質(zhì)干擾

環(huán)境樣品中共存的主要的金屬離子、大分子和小分子可能對肝素鈉的檢測存在干擾。為了考察Mn-ZnS QDs與OA-POSS納米復(fù)合物RTP探針的對肝素鈉的選擇性，對可能共存的過量的金屬離子(如 K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+和 Cu2+)、葡萄糖及腐殖酸等加入到含1 μM的肝素鈉的Mn-ZnS QDs與OA-POSS納米復(fù)合物體系中，檢測干擾物質(zhì)加入前后的RTP光譜。結(jié)果如表1所示，各種過量的干擾物質(zhì)的加入對RTP強度產(chǎn)生的影響在±5%的范圍內(nèi)。此外，腐殖酸作為有機復(fù)合物的代表物，在pH為7.0的溶液中，也同樣對肝素鈉的檢測無干擾。上述結(jié)果表明Mn-ZnS QDs與OA-POSS納米復(fù)合物RTP探針可用于選擇性肝素鈉的檢測。

表1 各種共存基質(zhì)對Mn-ZnSQDs與OA-POSS納米復(fù)合物RTP探針檢測肝素鈉的影響

2.5 實際樣品分析

為了論證Mn-ZnS QDs與OA-POSS納米復(fù)合物RTP探針的適用性，污水廠尾水被用于肝素鈉的分析檢測。如表2所示，尾水樣品經(jīng)過適當(dāng)稀釋后加入標(biāo)準(zhǔn)的肝素鈉后，能夠獲得好的定量回收率(95～101%)，且可以使用一個簡單的標(biāo)準(zhǔn)溶液來精確定量肝素鈉。

表2 實際水樣品中肝素鈉探測的三次測定回收率

3 結(jié)論

總之，荷正電的OA-POSS與荷負(fù)電的半胱氨酸包裹的Mn-ZnS QDs在溶液中由于靜電作用發(fā)生點間聚集，形成OA-POSS與Mn-ZnS QDs納米復(fù)合物，OA-POSS的電場誘導(dǎo)了RTP的增強。當(dāng)荷更高負(fù)電的肝素鈉加入到上述體系中，肝素鈉與QDs競爭，使得舊的納米復(fù)合物解體，新的OAPOSS與肝素鈉納米復(fù)合物形成。舊的納米復(fù)合物的解體使Mn-ZnS QDs的RTP逐漸衰減，并應(yīng)用于復(fù)雜樣品中肝素鈉的選擇性檢測，這已經(jīng)被證實是一種有效且實用的技術(shù)。