封夢娟,楊正標,張 芹,宋寧慧,劉艷華,郭瑞昕,陳建秋*,張圣虎*

(1. 中國藥科大學工學院, 江蘇 南京 211198; 2. 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學研究所,江蘇 南京 210042; 3. 南京市環(huán)境監(jiān)測中心站, 江蘇 南京 210013)

藥物及個人護理品(PPCPs)作為一類新型污染物因其在環(huán)境中的殘留和潛在危害引起了各國環(huán)境學者的廣泛關注[1-7]?？股厥且活惓Ｒ姷腜PCPs類物質,已經(jīng)被廣泛用于人類和動物治療，以及預防細菌、致病微生物感染的疾病中,同時也被作為促生長藥物廣泛用于畜牧業(yè)和水產養(yǎng)殖業(yè)[8-11]。近年來抗生素被大量頻繁使用,在天然水體、沉積物、水生生物、土壤等環(huán)境介質中被廣泛檢出[12-17],濃度水平多在痕量級別(ng/L～μg/L)?？股乜稍谳^低水平下對病原菌產生作用,因此會使耐藥菌在環(huán)境中被誘發(fā)和散播,嚴重干擾生態(tài)環(huán)境,進而給人類健康帶來潛在風險[17-19]。

抗生素種類繁多,目前還沒有統(tǒng)一標準用于環(huán)境樣品中多種抗生素的分析,現(xiàn)有的分析方法主要包括薄層色譜法、毛細管電泳法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜-紫外/熒光法和高效液相色譜-串聯(lián)質譜法等[20-26]。唐慧玲和尹鴻萍[20]利用薄層色譜-生物自顯影聯(lián)用原位技術檢測農副產品中的抗生素殘留,結果表明100份樣品中有72份檢出抗生素殘留;王寧[21]建立了大體積樣品堆積-區(qū)帶毛細管電泳同時分離測定水產品中氟喹諾酮類和磺胺類抗生素的方法,檢出限為13～33 μg/L;韓敏奇等[22]采用酶聯(lián)免疫法快速檢測長江原水中四環(huán)素的含量,結果表明其含量均小于檢出限;王橋軍等[23]采用固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定水中喹諾酮類抗生素含量,4種目標化合物的檢出限為0.083～0.248 g/L。上述4種方法僅能滿足定性篩查,以及定量分析種類和數(shù)量較少的環(huán)境樣品中抗生素的含量。然而在實際抗生素污染監(jiān)測中,污染對象具有很大的不確定性,因此開發(fā)多類別多種抗生素快速準確的分析方法就顯得尤為重要。高效液相色譜-串聯(lián)質譜法具有特異性強、靈敏度高等特點,已經(jīng)越來越廣泛的應用于抗生素分析中。楊常青等[24]采用正、負離子同時掃描模式建立了固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質譜法對河流水體中4類16種抗生素的定量分析;杜鵑等[25]建立了固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時檢測水中6類23種抗生素的分析方法,并將其應用于海水中抗生素殘留的分析中。

本研究采用固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術,建立了地表水中5類(磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內酯類和青霉素類)40種抗生素同時定量的分析方法,應用本方法對長江南京段16個地表水點位進行抗生素污染篩查。該法可為深入了解我國區(qū)域水環(huán)境中抗生素的賦存水平提供數(shù)據(jù),也可為環(huán)境生態(tài)風險提供參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀(UPLC: 1 290 Infinity,美國Agilent公司;MS: QTRAP 4 500,美國AB SCIEX公司);旋轉蒸發(fā)儀(R-300,瑞士Buchi公司);萃取小柱(Oasis HLB,美國Waters公司);電子天平(AG-285,瑞士Mettle公司);超純水儀(Milli-Q,美國Millipore公司);送風定溫干燥箱(WF0-700W,上海愛郎儀器有限公司)。

甲醇和乙腈(色譜純,德國Merck公司);甲酸和氨水(色譜純,國藥集團藥業(yè)股份有限公司);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)、磷酸和二氫鈉磷酸(分析純,南京化學試劑有限公司)。

40種抗生素標準品包括(1)磺胺類(SAs):乙?；前?SA)、磺胺吡啶(SNM)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲惡唑(SMX)、磺胺甲嘧啶(SMZ)、磺胺甲二唑(SMT)、苯甲?；前?SBD)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺對甲氧嘧啶(SMD)、磺胺鄰二甲氧嘧啶(SD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺間二甲氧嘧啶鈉(SDM)、磺胺噻唑(ST)、甲氧芐啶(TRI)、磺胺二甲異唑(SOX)和磺胺甲氧噠嗪(SPD); (2)喹諾酮類(FQs):諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、洛美沙星(LOM)、恩諾沙星(ERX)、依諾沙星(ENX)、麻保沙星(MBX)、氟羅沙星(FLX)、氧氟沙星(OFX)和培氟沙星(PFLX); (3)四環(huán)素類(TCs):土霉素(OXY)、金霉素(CTE)、四環(huán)素(TCY)、土霉素(MET)和強力霉素(DOX); (4)大環(huán)內酯類(MAs):阿奇霉素(AZM)、羅紅霉素(ROX)、螺旋霉素(SPI)、克林霉素(CLI)、克拉霉素(CLR)、林可霉素(LIN)、泰樂菌素(TLS)和紅霉素(ERY); (5)青霉素類(Pen):青霉素G(PEN G)和氨芐西林(AMP),以上均購自百靈威科技有限公司,純度均大于99.0%。

上述標準品均用甲醇配制成1 000 mg/L的標準儲備液,并用甲醇配制成20 mg/L的40種抗生素混合標準儲備液,于-20 ℃冰箱儲存。使用時,用甲醇稀釋至所需濃度。

1.2 樣品的采集

2018年8月,沿長江南京段設置16個采樣點(S1～S16),采集表層(0～1 m)水體水樣,每個采樣點一次性采集1 L,置于棕色玻璃瓶中,運回實驗室。

1.3 提取和凈化

用量筒準確移取1 L水樣,經(jīng)0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾除雜后,添加5 mL 100 g/L的EDTA·Na2溶液,用50%(v/v)磷酸水溶液調節(jié)pH值至3.0左右,然后以4 mL/min的流速通過Oasis HLB小柱進行固相萃取。上樣前,依次用6 mL甲醇、3 mL超純水、6 mL 100 g/L磷酸二氫鈉溶液活化小柱。上樣后,用6 mL超純水淋洗,棄去淋洗液,負壓抽干30 min以上,再依次用6 mL甲醇、6 mL 2%(v/v)氨水甲醇溶液洗脫,且保持洗脫流速為1 mL/min。將洗脫液在旋轉蒸發(fā)儀上蒸干,用甲醇復溶至1 mL,待HPLC-MS/MS分析。

1.4 分析條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:A為0.2%(v/v)甲酸水溶液,B為乙腈;流速:0.3 mL/min。流動相洗脫梯度:0～5 min, 99%A～90%A; 5～25 min, 90%A～50%A; 25～26 min, 50%A～99% A; 26～30 min, 99%A。進樣體積:5 μL。

離子源:電噴霧電離(ESI)源,正離子模式;離子源溫度:550 ℃;多反應離子監(jiān)測(MRM)模式;離子噴霧電壓:5 500 V;氣簾氣(CUR)壓力:35.0 kPa;噴霧氣(GS1)壓力:60.0 kPa;輔助加熱氣(GS2)壓力:65.0 kPa。40種抗生素的其他質譜參數(shù)見表1。

表 1 40種抗生素的母離子、子離子、碰撞能量(CE)、去簇電壓(DP)、射入電壓(EP)和碰撞室射出電壓(CEP)

表 1 (續(xù))

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

根據(jù)5類抗生素分子結構中的基團特征,同時參考相關文獻[25,27],最終選擇ESI+模式進行掃描,在MRM模式下進行監(jiān)測。采用半自動的質譜進樣方式,將40種100 μg/L的標準儲備液分別注入離子源,流速為5 μL/min。

質譜分析單個抗生素標準物質,選取響應最高的離子峰作為該物質的母離子(定量離子),然后進行二級質譜分析,對母離子進行破碎,得到碎片離子,選擇2個合適的離子作為子離子(定性離子),并對目標化合物的定量、定性離子對進行CE、DP、EP、CXP等質譜參數(shù)的優(yōu)化。最終得到40種抗生素在多反應監(jiān)測模式下的質譜參數(shù)(見表1)。

圖 1 40種抗生素(100 μg/L)的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of the 40 antibiotics (100 μg/L) 1. SA; 2. SDZ; 3. LIN; 4. ST; 5. SNM; 6. SMZ; 7. MBX; 8. ENX; 9. OXY; 10. MET; 11. FLX; 12. SM2; 13. NOR; 14. OFX; 15. PFLX; 16. CIP; 17. TCY; 18. LOM; 19. SMT; 20. SPD; 21. SMD; 22. ERX; 23. SMM; 24. AZM; 25. SPI; 26. SD; 27. CHL; 28. CLI; 29. SMX; 30. DOX; 31. SOX; 32. SBD; 33. SDM; 34. TRI; 35. ERY; 36. TLS; 37. CLR; 38. ROX; 39. PEN G; 40. AMP.

2.2 流動相條件的優(yōu)化

在酸性條件下,大部分目標抗生素在采用正離子(ESI+)模式掃描時響應較高[28]。因此本方法選擇正離子模式進行監(jiān)測分析,并分別以甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.2%(v/v)甲酸水溶液作為流動相,考察40種抗生素(100 μg/L)的色譜分離效果。結果表明,以甲醇-水為流動相時，目標化合物的質譜響應較好,但部分目標化合物未出峰,而以乙腈-0.2%(v/v)甲酸水溶液為流動相時,部分目標化合物的質譜響應明顯增強。因此,選擇乙腈-0.2%(v/v)甲酸水溶液作為流動相。40種抗生素(100 μg/L)的總離子流色譜圖見圖1。

2.3 洗脫條件的選擇

由于抗生素種類較多，各類抗生素之間理化差異較大，使用單一的有機溶劑洗脫得不到較好的洗脫效果。采用Oasis HLB固相萃取柱富集抗生素樣品時，常使用甲醇或2%(v/v)氨水甲醇溶液進行洗脫，文獻[29-31]顯示，采用12 mL甲醇洗脫時，非磺胺類抗生素的洗脫效果較好，而采用12 mL 2%(v/v)氨水甲醇溶液洗脫能提高磺胺類抗生素的回收率。因此，采用6 mL甲醇和6 mL 2%(v/v)氨水甲醇溶液依次對固相萃取柱進行洗脫，以保證各抗生素均可獲得較高的回收率。

2.4 方法學確證

2.4.1標準曲線、檢出限與定量限

采用外標法定量,分別配制1、2、5、10、20、50、100和200 μg/L的40種抗生素混合標準溶液,用HPLC-MS/MS檢測后,以響應峰面積為縱坐標(y),其質量濃度為橫坐標(x, μg/L),繪制標準曲線。結果表明,在1～200 μg/L范圍內,目標化合物的峰面積與質量濃度呈良好的線性關系。以信噪比(S/N)≥3和S/N≥10定義儀器的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結果表明，40種抗生素的LOD和LOQ分別為0.001～1.252 μg/L和0.003～4.173 μg/L。對40種抗生素混合標準溶液(100 μg/L)連續(xù)測定3次,連續(xù)測定3天,計算日內和日間精密度,結果見附表1(詳見http://www.chrom-China.com,下同)。

2.4.2方法的回收率

根據(jù)已有文獻[28,32],大部分抗生素的暴露水平在ng/L～μg/L級別,以去離子水為基底進行加標回收試驗,加標水平為20 ng/L和200 ng/L,按照1.3節(jié)所述方法對樣品進行處理,設置3個平行樣,1個空白水樣,考察方法的回收率和精密度。結果表明,各目標抗生素的加標回收率為41.3%～112.6%,相對標準偏差為0.2%～14.0%(見附表1)。

2.4.3方法學比較

與其他已有文獻數(shù)據(jù)相比(見表2),回收率和檢出限可以滿足定量分析要求,此外,從總離子流色譜圖(見圖1)可以看出,40種抗生素在21 min內均可出峰。因此,本方法具有靈敏、高效和可靠的優(yōu)點。

表 2 與其他文獻方法的比較

QUs: quinolones; TCs: tetracyclines; MAs: macrolides; FQs: fluoroquinolones; GLs: glycopeptide; CPs: cephalosporins; CHs: chloramphenicol; AMs: amphenicols; RIs: rifamycins; LAs: lactams.

2.5 實際水樣分析

使用建立的方法對長江南京段16個表層水體中的抗生素進行分析,共檢出4類13種抗生素(見表3),含量為2.3～739.4 ng/L,其余抗生素含量均低于檢出限(nd)。磺胺類抗生素檢出磺胺嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺吡啶,含量低于中國漢江平原主要河流[44](nd～37.4 ng/L,均值13.4 ng/L)、黃河三角洲[45](2.2～764.9 ng/L,均值259.6 ng/L)和鄱陽湖[46](nd～56.2 ng/L),磺胺吡啶僅在S11采樣點檢出(8.3 ng/L)。喹諾酮類抗生素中恩諾沙星的檢出率為100%,含量范圍為0.3 ～ 8.6 ng/L,均值為1.1 ng/L,低于中國漢江平原主要河流[44](nd～53.1 ng/L,均值10.7 ng/L)的污染水平,其中S11處的含量為8.6 ng/L,可能存在點源污染;依諾沙星和氧氟沙星分別僅在S8(16.4 ng/L)和S3(2.3 ng/L)檢出,其余喹諾酮類抗生素含量均低于檢出限水平。四環(huán)素類抗生素僅檢出強力霉素,檢出率為62.5%,含量為nd～14.6 ng/L,均值為6.2 ng/L,低于中國香港的河流表層水[47](nd～82.2 ng/L,均值27.0 ng/L)以及國內鄱陽湖[46](nd～39.7 ng/L)的水平。大環(huán)內酯類抗生素中阿奇霉素、羅紅霉素、克林霉素、克拉霉素和林可霉素在水樣中均有檢出,檢出率順序為克拉霉素>克林霉素、林可霉素>阿奇霉素>羅紅霉素,而螺旋霉素、泰樂菌素和紅霉素均未檢出,其中水樣S14中克林霉素和林可霉素的含量分別為739.4 ng/L和22.0 ng/L,整體上,大環(huán)內酯類抗生素在長江南京段表層水中的含量顯著低于江漢平原主要河流[29](95.1～2 910 ng/L)。

表 3 長江南京段表層水中40種抗生素的暴露水平

Max: maximum contents; Ave: average contents; Med: medium contents; Fre: frequency; nd: less than LOD.

3 結論

建立了SPE-HPLC-MS/MS同時測定水體中5類40種抗生素的分析方法。該方法操作簡單,靈敏度高,穩(wěn)定性好。