錢 燁,張雅瑋,王 震,尹 敬,彭增起*,周光宏

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院, 江蘇 南京 210095; 2. 食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 南京 210095)

豬肉富含膽固醇,膽固醇是由甾體部分和一條長(zhǎng)的側(cè)鏈組成,甾體的四個(gè)環(huán)通常用A、B、C、D進(jìn)行編號(hào)[1]。新鮮豬肉中膽固醇氧化物(COPs)含量極低[2],但一經(jīng)加工處理,如腌制、加熱、光照以及長(zhǎng)時(shí)期貯存等,豬肉中的膽固醇極易在A環(huán)、B環(huán)或側(cè)鏈發(fā)生氧化而形成COPs[3,4]。目前研究表明,COPs可能有70余種,但大多數(shù)因自身極不穩(wěn)定而并不常見[5]。食品中常見的COPs有7-酮基膽固醇、7α-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、5α,6α-環(huán)氧化膽固醇、5β, 6β-環(huán)氧化膽固醇、膽甾烷-3β,5α,6β-三醇、20-羥基膽固醇和25-羥基膽固醇等[5]。醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明,食源性膽固醇氧化物會(huì)對(duì)健康造成一定損害,具有細(xì)胞毒性[6],并會(huì)導(dǎo)致血管動(dòng)脈粥狀硬化、癌癥以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[7]。

COPs的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[8-10]、氣相色譜法[11-13]、高效液相色譜法[14,15]、液相色譜-質(zhì)譜法[16]。其中，液相色譜儀的分離效果和所使用的色譜柱容量達(dá)不到COPs的分離要求[17],并且大多數(shù)膽固醇氧化物無紫外吸收和熒光,無法采用紫外或者熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[18]。液相色譜-質(zhì)譜法由于設(shè)備價(jià)格昂貴,因此用于分析COPs的研究報(bào)道較少。氣相色譜法在COPs上的應(yīng)用較多,大多采用氫火焰離子化檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[11,13,19]。而氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)兼顧了氣相色譜的高分辨率和質(zhì)譜的高靈敏度,能夠有效分離和檢測(cè)復(fù)雜化合物[20]。目前,我國(guó)對(duì)膽固醇及其代謝物的研究均有報(bào)道[21],但對(duì)肉制品中膽固醇氧化物研究較少,并且還未對(duì)膽固醇氧化物的分析方法建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),所以有必要建立快速準(zhǔn)確高效分析食品中膽固醇氧化物的檢測(cè)方法。本研究建立了氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定醬豬肉中5種COPs(7β-羥基膽固醇、5α,6α-環(huán)氧化膽固醇、膽甾烷-3β,5α,6β-三醇、25-羥基膽固醇和7-酮基膽固醇)含量的方法,為評(píng)價(jià)醬豬肉制品的安全性提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Bruker 450GC-320MS型氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國(guó)Bruker Daltonics公司); LB20ES型高速組織搗碎機(jī)(美國(guó)Waring Blender公司); LGJ-10C型冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司); SYC-2101型水平搖床(美國(guó)精騏有限公司); RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海研承儀器有限公司); SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠); SBEQ-CR1012型固相萃取裝置(德國(guó)CNW公司); DC-12H型氮吹儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司); KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司); Secura125-1CN型十萬分之一電子天平(德國(guó)Sartorius公司)。SPE硅膠柱(500 mg/6 mL,美國(guó)Supelco公司)。

5種COPs標(biāo)準(zhǔn)品:7β-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇、膽甾烷-3β,5α,6β-三醇(加拿大Toronto Research Chemicals公司); 7-酮基膽固醇(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司); 5α,6α-環(huán)氧化膽固醇(梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司)。衍生劑N,O-雙(三甲基硅基)乙酰胺-三甲基氯硅烷-三甲基硅基咪唑(3∶2∶3, v/v/v)(Sylon BTZ,美國(guó)Supelco公司)。乙酸乙酯和吡啶(色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。其余試劑:石油醚、甲醇、氯仿、正己烷、無水乙醚、丙酮、無水硫酸鈉、氫氧化鉀,均為國(guó)產(chǎn)分析純。

4.5月齡左右的三元豬前肘購(gòu)于南京市玄武區(qū)童衛(wèi)路農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。醬豬蹄(編號(hào)1～4)和醬豬肘(編號(hào)5～8)產(chǎn)品購(gòu)于北京、山東、無錫3個(gè)地區(qū),每種產(chǎn)品購(gòu)買3個(gè)批次(n=3)。8種產(chǎn)品的配料、保質(zhì)期及包裝方式見附表1(詳見http://www.chrom-China.com)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取5種COPs標(biāo)準(zhǔn)品各2 mg,置于50 mL容量瓶中,溶于乙酸乙酯中,并定容至50 mL,制得40 mg/L COPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(于4 ℃低溫避光保存),再用乙酸乙酯稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,5α,6α-環(huán)氧化膽固醇濃度梯度為0.4、0.8、4、12和20 mg/L,其余4種COPs濃度梯度均為0.06、0.1、0.8、4、12和20 mg/L,。

取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,用氮?dú)獯祾邼饪s至近干,溶解于1 mL無水吡啶中,移取50 μL,置于250 μL內(nèi)襯管中,再加入50 μL Sylon BTZ,漩渦混合10 s,于25 ℃避光衍生化1 h,取1 μL用于GC-MS分析,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 樣品前處理

將樣品用組織搗碎機(jī)絞碎成糜狀,準(zhǔn)確稱取5.0 g肉糜,凍干36 h后加入30 mL甲醇-氯仿(1∶2, v/v)混合液,振蕩萃取30 min。然后加入0.5 g無水硫酸鈉,濾紙過濾,除去殘余水分。濾液在40 ℃真空條件下蒸發(fā)至干后溶解于5 mL正己烷中,用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾,得到提取液。

硅膠柱用15 mL正己烷活化,將提取液全部上樣,過柱后棄去,然后依次用10 mL正己烷-乙醚(95∶5, v/v)、25 mL正己烷-乙醚(90∶10, v/v)和15 mL正己烷-乙醚(80∶20, v/v)溶劑淋洗,抽干,最后用5 mL丙酮洗脫,洗脫液收集于10 mL離心管中，用氮?dú)獯祾邼饪s至近干,用1 mL無水吡啶溶解,過0.2 μm有機(jī)濾膜,移取50 μL濾液,置于250 μL內(nèi)襯管中,再加入50 μL Sylon BTZ,漩渦混合10 s,將此混合物置于25 ℃避光衍生化1 h,取1 μL用于GC-MS分析。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度為280 ℃;載氣(氦氣)流速為0.8 ml/min;進(jìn)樣模式為不分流進(jìn)樣;柱溫升溫程序:初始溫度220 ℃,保持1 min,以15 ℃/min的速率升至270 ℃,保持1 min,再以1 ℃/min的速率升至280 ℃,保持2 min,再以5 ℃/min的速率升至290 ℃,保持10 min。進(jìn)樣體積為1 μL。

離子源為電子轟擊電離(EI)源;離子源溫度為220 ℃;電離能量為70 eV; GC-MS接口溫度為270 ℃;檢測(cè)模式為選擇離子掃描(SIM)模式;電子倍增管電壓為1 360 V。其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表 1 5種COPs的GC-MS采集參數(shù)

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的選擇

2.1.1程序升溫條件的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)中采取的升溫程序以及相應(yīng)的保留時(shí)間可知,COPs在色譜柱溫度達(dá)到200 ℃以上才能被檢出,表明經(jīng)衍生化處理后COPs的沸點(diǎn)仍然較高[22,23]。COPs結(jié)構(gòu)相似,保留時(shí)間較接近,過快的升溫速率會(huì)導(dǎo)致其分離效果降低。經(jīng)試驗(yàn)反復(fù)優(yōu)化,得到1.4節(jié)的柱溫升溫程序。對(duì)5種COPs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定性分析,監(jiān)測(cè)模式為全掃描模式,得到5種COPs的總離子流色譜圖(見圖1)。對(duì)各個(gè)色譜峰進(jìn)行庫檢索,得到7β-羥基膽固醇、5α,6α-環(huán)氧化膽固醇、膽甾烷-3β,5α,6β-三醇、25-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇的保留時(shí)間分別為17.19、18.17、20.05、21.50和21.78 min, 5種COPs可在22 min內(nèi)完成分離,且分離度較好,因此可以采用該升溫程序。

圖 1 5種COPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(2 mg/L)的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of of the fiveCOPs mixed standard solution (2 mg/L) 1. 7β-hydroxycholesterol; 2. cholesterol-5α,6α-epoxide; 3. 3β,5α,6β-trihydroxycholestane; 4. 25-hydroxycholesterol; 5. 7-ketocholesterol.

2.1.2質(zhì)譜檢測(cè)模式的選擇

由于COPs在食品中的含量較低,且食品成分復(fù)雜,若采用全掃描模式檢測(cè)樣品中的COPs,易受到雜質(zhì)干擾,因此采用選擇離子掃描模式,對(duì)各COPs的主要離子進(jìn)行檢測(cè)(見圖2),可有效降低雜質(zhì)干擾,增加檢測(cè)靈敏度。各COPs經(jīng)衍生化后,主要離子差異較大,若單以一組離子進(jìn)行5種COPs的檢測(cè),則所要選取的離子數(shù)目過多,靈敏度較低。因此,可以根據(jù)各物質(zhì)的主要離子,以及全掃描所得到的保留時(shí)間,將其分為4組,每組掃描5～6種離子。第一組為0～18 min,檢測(cè)7β-羥基膽固醇;第二組為18～19 min,檢測(cè)5α,6α-環(huán)氧化膽固醇;第三組為19～21 min,檢測(cè)膽甾烷-3β,5α,6β-三醇;第四組為21 min至層析結(jié)束,檢測(cè)25-羥基膽固醇和7-酮基膽固醇。選擇峰面積最大的離子作為各物質(zhì)的定量離子,如圖2所示,分別為m/z457、384、403、131、472的離子。

圖 3 不同提取方法對(duì)5種COPs回收率的影響(n=3)Fig. 3 Influences of different extraction methodson the recoveries of the five COPs (n=3) Different letters in the same COP indicated significant differences between the different extraction methods.

2.2 樣品前處理方法的選擇

2.2.1提取方法的選擇

根據(jù)報(bào)道,使用最頻繁的提取方法是將2種或者3種溶劑以不同的比例混合,充分提取不同極性的脂類物質(zhì),同時(shí)將其他非脂類物質(zhì)去除,避免提取液基質(zhì)的復(fù)雜性,最常用的提取溶劑是甲醇-氯仿(1∶2, v/v)[24]。Tatiana等[25]提出直接對(duì)食品基質(zhì)進(jìn)行皂化處理,皂化處理能使基質(zhì)中主要的?；视娃D(zhuǎn)化成水溶性的羧酸鹽和游離甘油,從而得以去除,最后提取出COPs等不皂化物。過高的皂化溫度會(huì)增加膽固醇被氧化和膽固醇氧化物被再次氧化的可能性[26],所以目前多采用冷皂化方式,即在25 ℃條件下反應(yīng)18～22 h,然后提取出非皂化物質(zhì)[27]。索氏抽提法是常用的提取粗脂肪的方法,具有易操作、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),是公認(rèn)的經(jīng)典方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用甲醇-氯仿(1∶2, v/v)萃取比直接皂化法和索氏抽提法更高效(見圖3)。采用甲醇-氯仿(1∶2, v/v)萃取時(shí),5種COPs的回收率為61.31%～93.67%,顯著高于直接皂化法和索氏抽提法(P<0.05)。Lozada-Castro等[15]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)采用直接皂化法提取火腿中的膽固醇氧化物時(shí),易發(fā)生乳化反應(yīng),導(dǎo)致操作難以進(jìn)行。Busch等[28]發(fā)現(xiàn)，直接皂化法不適用于肉制品等成分復(fù)雜的樣品。方益等[29]提出,索氏抽提法由于在高溫條件下進(jìn)行,會(huì)造成膽固醇氧化物之間相互轉(zhuǎn)化或分解,導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。因此最終選用甲醇-氯仿(1∶2, v/v)萃取的方法進(jìn)行提取。

2.2.2凈化方法的選擇

提取脂溶性物質(zhì)后,通常采用SPE法或皂化-固相萃取法對(duì)提取物進(jìn)行凈化處理。在固相萃取前進(jìn)行皂化處理可將粗脂肪提取物中的主要成分?；视娃D(zhuǎn)化為水溶性的脂肪酸鹽和游離甘油,從而得以去除,并且皂化反應(yīng)可水解膽固醇酯,使結(jié)合態(tài)的膽固醇氧化物游離出來[23]。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,直接進(jìn)行固相萃取時(shí)，COPs的回收率顯著高于皂化-固相萃取法(P<0.05)(見圖4)。采用皂化-固相萃取法時(shí),7-酮基膽固醇的回收率僅為30.46%,這是由于皂化反應(yīng)在堿溶液中進(jìn)行,7-酮基膽固醇等不穩(wěn)定的COPs極易發(fā)生分解[27]。Clariana等[30]也發(fā)現(xiàn)在冷皂化過程中,常常發(fā)生COPs的分解或轉(zhuǎn)化,這可能是導(dǎo)致某些COPs在經(jīng)皂化法凈化后回收率較低的原因。固相萃取法能夠?qū)⑻崛〕龅闹愇镔|(zhì)如甘油三酯、膽固醇及其氧化物、磷脂等按照不同的極性分離,分離效率高。由圖4可以看出,采用直接固相萃取法時(shí),5種COPs的回收率為61.31%～93.67%,滿足檢測(cè)要求。因此最終沒有采用皂化步驟,提取脂類物質(zhì)后,直接采用固相萃取法進(jìn)行樣品的凈化。

圖 4 不同凈化方法對(duì)5種COPs回收率的影響(n=3)Fig. 4 Influences of different purification methodson the recoveries of the five COPs (n=3) Different letters in the same COP indicated significant differences between the different purification methods.

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限

按1.2節(jié)配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各組分定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)(y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/L),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)定義為產(chǎn)生3倍和10倍信噪比(S/N)時(shí)化合物的質(zhì)量濃度。選取一系列質(zhì)量濃度較低的5種COPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.4節(jié)色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行分析檢測(cè),計(jì)算LOD和LOQ。結(jié)果表明,7β-羥基膽固醇、膽甾烷-3β,5α,6β-三醇、25-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇在0.03～10 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,5α,6α-環(huán)氧化膽固醇在0.2～10 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；5種COPs的檢出限和定量限分別為0.02～47.07 ng/g和0.06～156.90 ng/g(見表2)。實(shí)際樣品中,單種膽固醇氧化物的含量一般為0～2.5 mg/kg,換算為進(jìn)樣濃度為0～6.25 mg/L,因此該方法的線性范圍可滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求。

表 2 5種COPs的線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R2)、回歸方程、檢出限和定量限

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

表 3 空白生豬肉樣品中5種COPs的加標(biāo)回收率和精密度(n=3)

2.3.2回收率和精密度

選取新鮮豬前肘皮、皮下脂肪、瘦肉部分,分別制成肉糜,凍干后作為空白樣品。添加濃度為高、中、低3個(gè)水平的COPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,按1.3節(jié)和1.4節(jié)所述方法進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定,每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定3次(n=3),結(jié)果顯示,5種COPs的加標(biāo)回收率為61.16%～96.96%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤7.80%(見表3),其精密度滿足豬肘皮、皮下脂肪、瘦肉中COPs含量的檢測(cè)要求。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用所建方法分析測(cè)定市售醬豬蹄和醬豬肘中COPs的含量。結(jié)果顯示,醬豬蹄皮中COPs總量為422.1～1 083.3 ng/g,皮下組織中COPs總量為855.2～1 794.7 ng/g(見表4);醬豬肘皮中COPs總量為690.0～3 767.2 ng/g,皮下脂肪中COPs總量為538.9～4 275.1 ng/g,瘦肉中COPs總量為641.1～3 848.8 ng/g(見表5)。這與Chen等[31]的結(jié)果相似,其研究發(fā)現(xiàn),加熱24 h后醬豬蹄皮中COPs總量為1 497.8 ng/g,肉中COPs總量為1 565.5 ng/g。醬豬蹄肉中COPs含量顯著高于皮中,可能是因?yàn)槿庵醒t素鐵等金屬離子含量較高,金屬離子會(huì)促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致自由基的快速形成,膽固醇在自由基的攻擊下發(fā)生氧化反應(yīng)[32,33]。

皮下脂肪樣品2和樣品6中未檢出5α,6α-環(huán)氧化膽固醇,瘦肉樣品6中未檢出膽甾烷-3β,5α,6β-三醇,產(chǎn)品中COPs種類和含量存在差異，可能與其加工方式和添加物不同有關(guān)。結(jié)合附表1可知,保質(zhì)期長(zhǎng)的產(chǎn)品中COPs總量顯著高于保質(zhì)期短的產(chǎn)品,這可能是因?yàn)楸Ｙ|(zhì)期長(zhǎng)的產(chǎn)品在高溫殺菌過程中進(jìn)行了二次加熱,促進(jìn)了COPs的形成。

3 結(jié)論

建立了氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定醬豬肉中5種COPs含量的檢測(cè)方法。該方法的線性范圍、檢出限、定量限、回收率和精密度均能夠滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求。通過對(duì)市售醬豬蹄和醬豬肘中COPs的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)保質(zhì)期長(zhǎng)的產(chǎn)品中COPs含量顯著高于保質(zhì)期短的產(chǎn)品,該結(jié)果將為進(jìn)一步研究傳統(tǒng)醬鹵豬肉制品的加工方式與危害,以及膽固醇氧化物的消減技術(shù)提供參考。