牛病毒性腹瀉病診斷技術(shù)研究進展

李新紅

牛病毒性腹瀉病主要癥狀為呼吸系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、胃腸道疾病，降低牛群的生產(chǎn)力和經(jīng)濟活動，最后是免疫抑制癥狀。本文綜述了牛病毒性腹瀉的現(xiàn)狀及現(xiàn)有的診斷技術(shù)，以期為牛病毒性腹瀉防治研究提供理論依據(jù)。

1 BVDV的分離和鑒定

BVDV的傳播渠道多樣，一般通過牛的腔道分泌物、血液、脾臟淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)進行傳播，胎牛腎細胞和小牛睪丸細胞接種進行分離鑒定。

2 血清學(xué)診斷

2.1 中和試驗

在實驗室常被研究人員采用，它可有效診斷牛病毒性腹瀉疾病和黏膜相關(guān)疾病。于前3～4周采集病牛血液兩次，血清稀釋。如果第二次的效價高于第一次的效價的2倍以上可以確定為疑似疾病，4倍以上可以確定為陽性。但該方法也存在一定的診斷局限性，檢測到的病牛為陰性時，此?？赡転槊庖吣褪?。因此，若要準確、高效診斷群體牛病毒性腹瀉病還要結(jié)合其它有效方法。

2.2 免疫瓊脂擴散法

簡單可行，易于養(yǎng)殖場實驗人員操作。通常選擇潰瘍或炎癥組織周圍的黏膜直接與BVDV陽性血清反應(yīng)，檢測抗原。用標準陽性抗原檢測患病動物的血清也是可取的，但靈敏度低于中和試驗。陳茂生等采用該方法檢測BVDV抗體，并與微量中和試驗進行比較。國外學(xué)者也得出了同樣的結(jié)論，在檢測牛病毒性腹瀉病免疫瓊脂擴散法不能替代中和試驗方法。

2.3 蛋白A膠體金免疫電鏡法

快速、簡便，可直接用于病原體或細胞的鑒定，觀察病毒顆粒的形態(tài)。然而，它容易受到類似病毒粒子的干擾，特異性和敏感性低。觀察病毒顆粒本身是很困難的，需要107個病毒/毫升以上。

2.4 免疫過氧化物酶法

準確可靠，是診斷牛病毒性腹瀉病常用方法。目前，此方法已廣泛應(yīng)用于抗原的分布和抗體檢測。在該方法中，感染BVDV的細胞通過檢測單層細胞培養(yǎng)濃縮，且感染BVDV的細胞是無色的?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，將用生物素標記的抗小鼠抗體-鏈霉素抗生素蛋白連接的過氧化物酶檢測系統(tǒng)與單克隆抗體相結(jié)合可以有效提高檢測的特異性與精確度。

2.5 免疫熒光技術(shù)

一種新型技術(shù)，它將免疫的特異性、敏感性和顯微技術(shù)相互結(jié)合起來運用，能夠快速地檢測到病理組織中的病毒顆粒和受感染細胞培養(yǎng)物。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA方法）

一種很好的檢測方法，在BVDV檢測方面，可很好地檢測BVDV的抗體水平。利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，ELISA方法的檢測靈敏度高，特異性強，檢測準確率好。

3 BVDV的分子生物學(xué)檢測技術(shù)

3.1 核酸擴增技術(shù)

隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)在牛病毒性腹瀉病診斷中的應(yīng)用，核酸擴增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于實驗室診斷。在診斷牛病毒性腹瀉疾病時，主要的方法有體外循環(huán)（LAMP）等溫擴增、一步RT-PCR、雙RT-PCR、嵌套RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR等。這些技術(shù)可以區(qū)分不同基因型的BVDV菌株，從分子水平上檢測BVDV，具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強等特點。

3.2 核酸探針雜交

核酸探針雜交技術(shù)應(yīng)用廣泛，相比傳統(tǒng)的方法靈敏度高，特異性強。早期主要運用放射性同位素探頭，有放射性危害，而且穩(wěn)定性不足。后來人們研制出來用生物素標記的DNA探針，這種探針沒有放射性危害，然而其特異性沒有放射性同位素標記探針好。

4 小結(jié)

牛病毒性腹瀉在世界范圍內(nèi)一直廣泛的傳播，目前還無研究出有效的治療方法和高效的免疫方法，只有不斷改善對牛群的護理工作和加強有效對癥治療，增強牛群機體抵抗疾病的力，促進病牛的機體康復(fù)與痊愈。為了預(yù)防繼發(fā)感染，目前我國已成功研制生產(chǎn)可以接種不同年齡和品種牛的減毒凍干疫苗。接種疫苗后，牛在14天之后可以產(chǎn)生抗體并具有兩年的免疫期。國外許多學(xué)者也致力于牛病毒性腹瀉病毒致病機制以及疫苗的研究，特別是E0和E2的研究，為診斷牛病毒性腹瀉病技術(shù)的革新及新型疫苗的開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。