郝曉華，高改利，曹麗蓉，原庭玉，鞏瑞蘭

(忻州師范學院 生物系，山西 忻州 034300)

知母(AnemarrhenaRhizome)：百合科植物,具較強抗旱抗寒能力，是荒原山區(qū)的重要綠化品種.知母根莖烘干切片后可入藥，又稱“地參”.植株可直接用于外感熱病、清熱鎮(zhèn)咳、腸燥便秘[1]等癥.根莖具有防止血小板凝集、解熱、降低轉(zhuǎn)氨酶活性等多種藥理功能[2-4].黃酮類化合物(flavonoids)又名維生素P[5]，具很好的營養(yǎng)價值.其表現(xiàn)出良好的藥理功能，如降低血液黏度、減少血栓的凝集和血脂的形成、抗氧化、防衰老、消炎、止痛、殺菌等[6-8]，是一種具有極大實際應用前景的天然抗氧化物.

知母中甾體皂苷類、多糖類、黃酮類等活性物質(zhì)含量豐富[2].多數(shù)文獻側(cè)重于知母多糖類和皂苷類成分的提取分離與純化，關(guān)于知母根莖中總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究目前還鮮有報道，因此，很有必要對知母中黃酮類物質(zhì)的提取工藝與其抗氧化活性進行探究.

超聲波輔助法是常用的提取細胞內(nèi)容物的方法，具有省時、高效、低成本、簡便等優(yōu)點[9-10].本文通過正交法對提取條件進行優(yōu)化，并對知母黃酮進行抗氧化性研究，為進一步地研究知母中總黃酮的功效以及合理利用知母藥材資源與開發(fā)黃酮類制品提供部分參考.

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料

所用材料為知母根莖，2017年6月購自五臺山大藥房，干燥烘干，用組織粉碎機粉碎后過60目標準篩去除大顆粒性雜質(zhì)備用.

1.2 儀器與試劑

AL204高精密電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；LC-4016低速臺式離心機：安徽中科儀器有限公司；KQ3200DV超聲波清洗器：浙江賽德儀器有限公司；723PC紫外-可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；SHB-III標準型雙表循環(huán)水式真空泵：天津賽得利儀器有限公司.

蕓香苷標準品：合肥博美生物科技有限責任公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)：北京酷爾化學科技有限公司；95%乙醇、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、過氧化氫、氫氧化鈉、抗壞血酸，超純水，所用藥品與試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.3 實驗方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的繪制[11]

參照秦明有的方法，本實驗中設(shè)置蘆丁濃度為0-0.08 mg/mL等8個濃度梯度，5%亞硝酸鈉-4%氫氧化鈉-10%硝酸鋁-70%乙醇混合液為反應顯色劑并且當作對照溶液，在510 nm下測定吸光度OD值，每個濃度水平重復測定三次后取算術(shù)平均值.

1.3.2 知母總黃酮提取工藝流程

知母根莖→干燥→粉碎過篩→加入乙醇提取液→超聲波提取→水浴→離心→二次提取→合并上清液減壓抽濾并脫色→濃縮→定容→510 nm處測吸光值.

精密稱量已干燥過篩的知母粉末1.00 g于500 mL燒杯中；按一定料液比加入一定體積的70%乙醇，超聲波輔助浸提一定時間，后于70 ℃的水浴鍋中加熱0.5 h，4 200 r/min離心15 min取上清液，沉淀加提取劑重復上述步驟進行二次提取，合并上清液后加少量活性炭減壓抽濾得黃酮提取液母液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將母液濃縮至50 mL，取2 mL加顯色劑并定容至10 mL后于510 nm處測定吸光值.

1.3.3 總黃酮提取的單因素實驗

按照1.3.2的方法，設(shè)置料液比(1:10～1:60g/mL)，超聲提取時間(15～90 min)，超聲功率(75～150 W)，超聲溫度(40～90 ℃)，考察它們對知母總黃酮提取率的影響，進行單因素試驗時每個因素設(shè)置6個實驗水平，每個水平重復測定3次取平均值.按照1.3.4節(jié)中的方法計算黃酮萃取率.

1.3.4 總黃酮提取率的計算

知母總黃酮提取率的計算公式：

提取率/%=(C×V1×V)/(M×V2)×10-3×100%

式中：C為黃酮質(zhì)量濃度(g/mL)

V為母液總體積(50 mL)；

V1為待測液的體積(10 mL)；

V2為母液分取的體積(2 mL)；

M為知母粉末的質(zhì)量(1.00 g).

1.3.5 知母總黃酮提取工藝的正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，分別從4個因素的6個水平中篩選出3個較優(yōu)水平作為考察對象，開展優(yōu)化實驗.

用SPSS 20.0軟件設(shè)計L9(34)正交實驗，見表1.參照正交設(shè)計表中的組合進行提取實驗，測定提取率，優(yōu)選最佳組合.

表1 知母總黃酮提取工藝L9(34)因素水平表

1.4 抗氧化能力測定

1.4.1 DPPH·清除能力的測定

參照周寧[12]等人方法，將知母總黃酮提取液稀釋成不同濃度梯度(5,15,25,35,45 μg/mL)的樣品液，按下列組合分別加入各個試劑，混勻.按下式計算DPPH·清除率：

DPPH·清除率/%=[A0-(A-A1)]/A0×100%.

A:1 mL樣液+3 mLDPPH溶液.

A1:1 mL樣液+3 mL無水乙醇.

A0:1 mL蒸餾水+3 mLDPPH溶液.

將抗壞血酸配制成與總黃酮相同濃度梯度的樣液，測定Vc的DPPH·清除率.

1.4.2 對羥基自由基(·OH)清除能力的測定

參考楊喆等的方法[13-15]，將總黃酮提取液稀釋成一系列濃度梯度(2，4，6，8，10 mg/mL)的溶液，抗壞血酸配成相同濃度梯度的溶液.向試管中順次加入各個反應液，充分混勻.按下列公式計算·OH清除率：

·OH清除率/%=[A0-(A-A1)]/A0×100%.

A：實驗組吸光度.

A1：對照組吸光度.

A0：為試劑本底吸光度.

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

圖1 蘆丁標準曲線

見圖1，縱坐標為吸光度OD值，橫坐標為黃酮質(zhì)量濃度，得線性回歸方程為y=12.907x+0.002 5，回歸系數(shù)為R2=0.999 1的標準曲線.在濃度為0-0.07 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 料液比對提取率的影響

圖2所示為料液比對黃酮萃取得率的影響.總黃酮提取率先升后降.這是因為隨著料液比增大，細胞壁外滲透壓升高，黃酮相對濃度降低，利于細胞中黃酮類物質(zhì)的浸出，但料液比大于1∶40后，細胞內(nèi)非黃酮類雜質(zhì)溶出量增加，導致提取率下降，乙醇溶劑浪費.故選擇1∶20，1∶30，1∶40這三個水平進行后續(xù)正交試驗.

2.2.2 超聲時間對提取率的影響

圖3所示為超聲時間對提取率的影響.總黃酮提取率隨超聲時間的增加變化趨勢為先上升后下降.隨著超聲時間的延長，細胞破碎率和總黃酮溶出量都增加，到45 min時達到最大值，此時黃酮浸出率與雜質(zhì)浸出率基本達到平衡.超過45 min后，由于超聲波對黃酮結(jié)構(gòu)有破壞作用，雜質(zhì)浸出較多，目標產(chǎn)物提取率減小.且抽提時間過長易造成溶液粘稠度增大，抽濾難度增加，故選擇30 min，45 min，60 min三個水平做正交試驗.

圖2 不同料液比對總黃酮提取率的影響圖3 總黃酮提取率隨超聲時間的影響

2.2.3 超聲功率對提取率的影響

圖4所示為不同超聲功率對提取率的影響.總黃酮提取率隨著超聲功率的增大逐漸上升，120 W以后黃酮溶出增加速率開始降低，此時超聲功率對提取率的影響開始減弱.由于實驗中儀器限制，最大功率只能達到150 W,故選擇超聲功率120 W，135 W，150 W作為正交試驗的三個水平.

2.2.4 超聲溫度對提取率的影響

圖5為超聲溫度對提取率的影響.總黃酮提取率隨超聲溫度的升高先上升后下降，在40 ℃-60 ℃范圍內(nèi)，提取率上升較快，這是因為高溫加快分子活動，使黃酮浸出速度加快.而大于60 ℃以后，提取率反而下降，這是因為某些黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)在過高溫的環(huán)境中容易發(fā)生分解，且高溫下多糖類物質(zhì)分解速度和浸出速度加快，使細胞外液中雜質(zhì)含量增多.所以選擇50 ℃,60 ℃,70 ℃三個溫度水平作正交試驗.

圖4 不同超聲功率對總黃酮提取率的影響圖5 不同超聲溫度對總黃酮提取率的影響

2.3 總黃酮提取工藝的正交設(shè)計及結(jié)果

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，以4因素料液比(A)、超聲時間(B)、超聲功率(C)、超聲溫度(D)為考察對象，設(shè)計正交試驗表.正交設(shè)計及結(jié)果見表2，正交方差分析見表3.

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

注：R的數(shù)值越大表明該因素的水平變動對試驗結(jié)果的影響效果越明顯.

表3 正交實驗方差分析結(jié)果

注：P<0.01則表示極顯著；0.010.05則表示不顯著.

由正交試驗結(jié)果表中R值可知，各因素對提取率的影響程度依次為：料液比>超聲功率>超聲溫度>超聲時間,因素A(料液比)的極差(R)高達0.97，其對知母總黃酮提取率的影響最大.因素C(超聲功率)的極差是0.63，其對知母總黃酮提取率的影響較大.因素B(超聲時間)和D(超聲溫度)的極差分別為0.29，0.32，它們對提取率的影響差不多，在4因素中較小.通過比較k值可知，因素A與因素C的水平3為最優(yōu)，B與D的水平2最優(yōu).由方差分析表可知，液料比的P=0.007<0.01，對黃酮提取得率的影響極顯著.超聲功率的P值0.010.05，對黃酮得率沒有顯著影響.綜合上述，可以確定總黃酮提取的最佳工藝條件為A3B2C3D2，即料液比1∶40 g/mL、超聲時間45 min、超聲功率150 W、超聲溫度60 ℃.對該實驗組合進行檢驗以考察該工藝是否為最佳提取條件.

2.4 正交結(jié)果驗證實驗

準確稱取知母粉末3份各1.00 g，按工藝條件A3B2C3D2進行實驗測定提取率，重復測定3次，得提取率分別為1.52%，1.55%，1.53%.總黃酮提取率相近，無顯著差異，且平均值1.53%高于正交設(shè)計表中的最高值，說明工藝穩(wěn)定可靠，正交試驗結(jié)果可信.

2.5 總黃酮抗氧化性結(jié)果

2.5.1 清除DPPH·實驗結(jié)果

由圖6分析可知，知母總黃酮對DPPH·具有顯著清除能力，其對DPPH·的清除率隨質(zhì)量濃度的增大不斷增強.雖然在相同條件下知母總黃酮對DPPH·的清除能力始終略低于同濃度的Vc，但當其質(zhì)量濃度為25 μg/mL時清除率達50.7%，濃度為45 μg/mL時其清除率可達76.5%，其清除能力幾乎等同于抗壞血酸.此后，清除率基本保持穩(wěn)定.表明知母總黃酮對DPPH·有較好的清除作用.

2.5.2 清除·OH實驗結(jié)果

由圖7分析可知，知母總黃酮清除·OH的能力與質(zhì)量濃度基本呈正相關(guān)，清除率隨質(zhì)量濃度的增大不斷增強.總黃酮量為10 μg/mL時自由基清除率就可達到60.2%，在相同濃度下，總黃酮對自由基清除率的增加趨勢與抗壞血酸的自由基清除率增加趨勢基本相同，但總黃酮對·OH的清除能力始終低于抗壞血酸.

圖6 知母總黃酮與抗壞血酸清除DPPH·能力比較圖7 知母總黃酮與抗壞血酸清除·OH能力比較

3 結(jié)論

本實驗采用超聲波輔助乙醇溶劑法提取知母根莖中總黃酮，通過單因素和正交實驗，確定最佳提取工藝.實驗結(jié)果顯示，總黃酮提取的最佳工藝條件為料液比1∶40 g/mL、超聲時間45 min、超聲功率150 W、超聲溫度60 ℃.該工藝下平均提取率達到1.53%，即提取量為15.30 mg/g.正交驗證實驗中，3次重復實驗提取率分別為1.52%，1.55%，1.53%，相差不大，說明該正交結(jié)果穩(wěn)定可靠.抗氧化能力測定實驗中，隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大，對DPPH·與·OH的清除能力都逐漸增強，其抗氧化能力與濃度基本呈正相關(guān)，雖與抗壞血酸相比其抗氧化性略差，但知母總黃酮仍具有良好的自由基清除能力.