知柏龍膽片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

李 潔， 楊 駿， 何 琳， 陸蕙蘭

（上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院藥劑科， 上海 200020）

近年來研究發(fā)現(xiàn)， 應(yīng)用滋陰降火中成藥治療兒童性早熟的療效顯著， 并通過動物模型闡釋其機(jī)理[1-3］。 知柏龍膽片（SYZ-ZF-087-2005） 源于上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科經(jīng)驗方， 為補(bǔ)陰名方大補(bǔ)陰丸化裁而得， 是由黃柏、知母、 熟地黃、 醋龜甲、 龍膽5 味藥材組成的中藥復(fù)方制劑， 具有滋陰降火之功效， 臨床用于治療生長發(fā)育加速（性早熟）[4］。 但目前該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)過于簡單， 而中藥方劑由多味藥材組成[5］， 常以“君臣佐使” 規(guī)律相互制約和協(xié)調(diào)， 強(qiáng)調(diào)從整體上發(fā)揮作用， 僅靠單一成分難以全面反映其內(nèi)在質(zhì)量。 因此， 在已有研究基礎(chǔ)上， 本實驗增加知柏龍膽片中黃柏、 龍膽、 龜甲、 知母等藥材的定性定量測定， 以保證臨床用藥安全有效[6-7］、 含有量均一[8］， 并完善其質(zhì)量控制體系。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）， 配置VWD 檢測器； Phenomenex C18、 Shiseido C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； AUW220D 電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； XP205 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； Scanner3＆Linomat5 薄層掃描儀（瑞士卡瑪公司）； HWS26 恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）； 202-1A 真空干燥箱（上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營廠）； SK7210HP 超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）； DFY-400 粉碎機(jī) （上海精廣機(jī)械設(shè)備有限公司）； TC-15 電熱套（海寧新華醫(yī)療器械廠）。

1.2 飲片 黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid. 干燥樹皮的炮制品 （產(chǎn)地四川， 批號16041302）， 知 母 為 百 合 科 植 物 知 母 Anemarrhena asphodeloides Bge. 干燥根莖的炮制品 （產(chǎn)地河北， 批號16120803）， 熟地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch. 干燥塊根的炮制品（產(chǎn)地河南， 批號16051702），醋龜甲為龜科動物烏龜Chinemys reevesii （Gray） 背甲及腹甲的炮制品（產(chǎn)地廣東， 批號17011702）， 龍膽為龍膽科植物龍膽Gentiana scabra Bunge. 干燥根和根莖的炮制品（產(chǎn)地遼寧， 批號17010303）。 以上飲片均購自上海華濟(jì)藥業(yè)有限公司， 經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)專家鑒定為正品。

1.3 試藥 芒果苷（批號111607-200402）、 知母皂苷BⅡ（批 號 111839-201102）、 鹽 酸 小 檗 堿 （批 號 110713-201613）、 賴氨酸（批號L103479）、 亮氨酸（批號140687-201102）、 纈氨酸（批號140681-200401）、 龍膽苦苷（批號110770-201515） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。 知柏龍膽片（批號170301、 170601、 170801）， 由上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院提供。 乙腈、 甲醇為色譜純（德國Merck 公司）； 其余試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 定性鑒別

2.1.1 醋龜甲 取本品適量， 研碎至細(xì)粉， 稱取1 g， 加10 mL 水加熱至沸， 放冷， 離心（10 000 r／min） 10 min，取上清液， 作為供試品溶液； 取處方中除醋龜甲外其余飲片， 按照生產(chǎn)工藝制備缺醋龜甲陰性供試品， 同法制成相應(yīng)溶液； 取賴氨酸、 亮氨酸、 纈氨酸對照品， 加水制成每1 mL 分別含1、 1、 0.5 mg 上述成分的溶液， 作為對照品溶液。 按照2015 年版《中國藥典》 四部薄層色譜法（通則0502）， 吸取陰性供試品溶液5 μL、 3 種對照品溶液各5 μL、 供試品溶液10、 2 μL， 點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4 ∶1 ∶1） 為展開劑， 展開， 取出，晾干， 噴以茚三酮試液， 105 ℃下加熱至斑點顯色清晰，結(jié)果見圖1。 由圖可知， 供試品色譜在對照品（點樣量10 μL） 相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點[9-10］， 陰性無干擾， 同時在2 μL 點樣量下斑點較淡， 故選擇點樣量為10 μL。

圖1 醋龜甲TLC 色譜圖

2.1.2 知母 取本品適量， 研碎至細(xì)粉， 稱取1 g， 加10 mL稀乙醇超聲（53 kHz、 20 ℃） 20 min， 放冷， 離心（10 000 r／min） 10 min， 取上清液， 作為供試品溶液； 取處方中除知母外其余飲片， 按照生產(chǎn)工藝制備缺知母陰性供試品， 同法制成相應(yīng)溶液； 取芒果苷對照品， 加稀乙醇制成每1 mL 含1.0 mg 該成分的溶液， 作為對照品溶液。按照2015 年版 《中國藥典》 四部薄層色譜法 （通則0502）， 吸取對照品溶液5 μL、 供試品溶液10 μL、 陰性供試品溶液5 μL， 點于同一聚酰胺薄膜上， 以乙醇-水（1 ∶1） 為 展 開 劑， 展 開， 取 出， 晾 干， 置 于 紫 外 光 燈（365 nm） 下檢視， 結(jié)果見圖2。 由圖可知， 供試品色譜在對照品相應(yīng)位置上顯相同顏色熒光斑點， 陰性無干擾。

圖2 知母TLC 色譜圖

2.2 HPLC 含有量測定

2.2.1 鹽酸小檗堿

2.2.1.1 色譜條件 填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠； 流動相乙腈-0.1%磷酸（50 ∶50） （每100 mL 加0.3 g 十二烷基磺酸鈉）； 檢測波長265 nm； 柱溫30 ℃。 理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算， 應(yīng)不低于4 000。

2.2.1.2 供試品溶液制備 取本品10 片， 研碎至細(xì)粉，精密稱取0.5 g， 置于錐形瓶中， 精密加入75% 甲醇100 mL， 稱定質(zhì)量， 回流45 min， 冷卻， 75% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 0.22 μm 微孔濾膜過濾， 取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.3 陰性供試品溶液制備 根據(jù)處方比例取除黃柏外其余飲片， 按照生產(chǎn)工藝制備缺黃柏供試品， 按“2.2.1.1” 項下方法制備， 即得。

2.2.1.4 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量， 加甲醇制成每1 mL 含21.52 μg 該成分的溶液， 即得。

2.2.1.5 專屬性考察 檢測波長選擇2015 年版《中國藥典》 一部黃柏項下的265 nm， 對照品、 供試品、 陰性供試品溶液在“2.2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定， 發(fā)現(xiàn)陰性無干擾， 色譜圖見圖3。

圖3 鹽酸小檗堿HPLC 色譜圖

2.2.1.6線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量， 流動相制成1.076 mg／mL 貯備液， 稀釋10 倍， 精密吸取適量， 甲醇制成2.152、 4.304、 10.76、 21.52、 53.80、107.6、 215.2 μg／mL 對照品溶液， 在“2.2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測定。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 得方程為Y=42.607X＋10.231 （r=1）， 在2.152～215.2 μg／mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.1.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液（21.52 μg／mL）10 μL， 在“2.2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定， 測得鹽酸小檗堿峰面積RSD 為0.99%， 表明儀器精密度良好。

2.2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取本品（批號170301） 適量， 按“2.2.1.2” 項下方法制備供試品溶液， 室溫下于0、 2、 4、6、 8、 10、 12、 24 h 在“2.2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定， 測得鹽酸小檗堿峰面積RSD 為1.10%， 表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.1.9 重復(fù)性試驗 取本品（批號170301） 6 份， 按“2.2.1.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定， 測得鹽酸小檗堿含有量RSD 為1.93%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.1.10 加樣回收率試驗 精密稱取9 份鹽酸小檗堿含有量已知（2.91 mg／g） 的本品， 每份0.25 g， 加入對照品溶液（2.51 mg／mL） 0.15、 0.3、 0.45 mL， 各3 份， 分別相當(dāng)于取樣量的0.5、 1、 1.5 倍， 按“2.2.1.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.2.2 龍膽苦苷

2.2.2.1 色譜條件 填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠； 流動相甲醇-水（25 ∶75）； 檢測波長270 nm； 柱溫30 ℃。 理論塔板數(shù)按龍膽苦苷峰計算， 應(yīng)不低于3 000。

2.2.2.2 供試品溶液制備 取本品10 片， 研碎至細(xì)粉，精密稱取0.5 g， 置于錐形瓶中， 精密加入50%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量， 超聲（53 kHz、 20 ℃） 45 min， 冷卻， 50% 乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 0.45 μm 微孔濾膜過濾， 取續(xù)濾液， 即得。

2.2.2.3 陰性供試品溶液制備 根據(jù)處方比例取除龍膽外其余飲片， 按照生產(chǎn)工藝制備缺龍膽供試品， 按“2.2.2.2” 項下方法制備， 即得。

2.2.2.4 對照品溶液制備 精密稱取龍膽苦苷對照品適量， 加甲醇制成每1 mL 含50.4 μg 該成分的溶液， 即得。

2.2.2.5 專屬性考察 檢測波長選擇2015 年版《中國藥典》 一部龍膽項下的270 nm， 對照品、 供試品、 陰性供試品溶液在“2.2.2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定， 發(fā)現(xiàn)陰性無干擾， 色譜圖見圖4。

2.2.2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取龍膽苦苷對照品適量，甲醇制成0.100 8 mg／mL 貯備液， 精密吸取適量， 甲醇制成5.040、 10.08、 25.20、 50.40、 100.8、 201.6 μg／mL 對照品溶液， 在“2.2.2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 得方程為Y=26.781X-0.622 8（r=1）， 在5.040～201.6 μg／mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液（50.4 μg／mL）， 在“2.2.2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣10 μL測定6 次， 測得龍膽苦苷峰面積RSD 為0.37%， 表明儀器精密度良好。

圖4 龍膽苦苷HPLC 色譜圖

2.2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取本品（批號170301） 適量， 按“2.2.2.2” 項下方法制備供試品溶液， 室溫下于0、 2、 4、6、 8、 10、 12、 24 h 在“2.2.2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定， 測得龍膽苦苷峰面積RSD 為0.30%， 表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.2.9 重復(fù)性試驗 取本品（批號170301） 6 份， 按“2.2.2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.2.2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定， 測得龍膽苦苷含有量RSD 為0.96%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱取9 份龍膽苦苷含有量已知（1.96 mg／g） 的本品， 每份0.25 g， 加入對照品溶液（1.74 mg／mL） 0.15、 0.25、 0.4 mL， 各3 份， 分別相當(dāng)于取樣量的0.5、 1、 1.5 倍， 按“2.2.2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.2.2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定， 結(jié)果見表2。

表2 龍膽苦苷加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.2.3 樣品含有量測定 取本品3 批 （批號170301、170601、 170801）， 按“2.2.1.2” 和“2.2.2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.2.1.1” 和“2.2.2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定， 計算含有量， 結(jié)果見表3。 根據(jù)3 批平均含有量， 取其80%作為下限， 結(jié)合片劑質(zhì)量0.3 g／片， 擬制定知柏龍膽片中鹽酸小檗堿、 龍膽苦苷含有量分別不低于0.72、 0.45 mg／片。

表3 各成分含有量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

本實驗采用硅膠G 薄層板作為固定相， 以正丁醇-冰醋酸-水（4 ∶1 ∶1） 為展開劑， 茚三酮試液為顯色劑， 加熱顯色， 制訂了龜甲TLC 定性鑒別項。 在制訂知母TLC 定性鑒別項時， 發(fā)現(xiàn)以知母皂苷BⅡ為對照品無法消除陰性供試品干擾， 最終確立以芒果苷為對照品。

本實驗在測定鹽酸小檗堿含有量時， 考察了乙腈-磷酸二氫鉀（50 ∶50） （每100 mL 加0.2、 0.3 g 十二烷基磺酸鈉和0.2 g 磷酸二氫鉀） 流動相[11］、 柱溫、 檢測波長、 色譜柱； 在制備供試品溶液時， 考察了提取方法（回流、 超聲）、 提取溶劑（25%甲醇、 50%甲醇、 75%甲醇、 25%乙醇、 50%乙醇、 75% 乙醇）、 提取時間（15、 30、 45、 60、90 min）， 最 終 確 定 “2.2.1.1” 項 下 色 譜 條 件 和“2.2.1.2” 項下供試品溶液制備方法。 在測定龍膽苦苷含有量時， 流動相考察了乙腈-0.4% 磷酸（12 ∶88）[12］、 乙腈-水（12 ∶88）[13］， 發(fā)現(xiàn)分離度不好， 而“2.2.2.1” 項下色譜條件[14］可獲得良好的分離效果， 而且基線平穩(wěn)， 峰形對稱。

4 結(jié)論

本實驗建立TLC、 HPLC 法建立知柏龍膽片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)， 該方法簡便準(zhǔn)確， 重復(fù)性好， 可為該制劑的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。