高效解磷細菌菌株CT45-1的鑒定及其對煙草的促生作用

劉春菊 杜傳印 梁子敬 夏磊 張德珍

摘要：使用以Ca3（PO4）2為唯一磷源的NBRIP液體培養(yǎng)基，對一株來源于濰坊煙區(qū)根際土壤的高效解磷細菌菌株CT45-1的解磷能力進行定量測定分析，并利用分子生物學(xué)方法對該菌株進行鑒定;通過盆栽試驗，了解菌株CT45-1對煙株的促生作用。定量分析結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時間的增加，接種菌株CT45-1的液體培養(yǎng)基中可溶性磷含量先增加后降低并趨于穩(wěn)定，振蕩培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)液中可溶性磷含量最高，為246.99 mg/L;培養(yǎng)過程中pH值先降低后升高，然后趨于穩(wěn)定，48 h 時pH值最?。?.17）。經(jīng)recA 序列分析，將CT45-1鑒定為新洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cenocepacia）。盆栽試驗結(jié)果表明，不同處理濃度的CT45-1菌液處理煙株后，其株高、鮮重均顯著高于對照，植株全磷含量分別比對照高30.28%、22.40%。

關(guān)鍵詞：煙草根系;解磷細菌;鑒定;可溶性磷含量;促生作用

中圖分類號：S154.39文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）04-0074-05

Abstract The NBRIP liquid medium with Ca3（PO4）2 as the sole phosphorus source was used to quantitatively analyze the phosphate-dissolving ability of a high-efficiency phosphate-dissolving bacterial strain CT45-1 separated from the rhizosphere soil of Weifang tobacco-growing area. The strain was identified by molecular biological method， and its promoting-effect on tobacco growth was studied by pot experiment. The results of quantitative analysis showed that， with the increase of culture time， the soluble phosphorus content in the liquid medium with inoculated strain CT45-1 increased firstly， then decreased and tended to be stable. After 48 hours of shaking culture， the soluble phosphorus in the culture solution had the highest content as 246.99 mg/L. The pH value decreased firstly， then rose and stabilized during the culture. The pH value as 3.17 was minimum at the 48th h. The strain CT45-1 was identified as a new Burkholderia cenocepacia by recA sequence analysis. The results of pot experiment showed that the plant height and fresh weight of tobacco treated by two concentrations of CT45-1 bacterial solution were significantly higher than those of the control， and the total phosphorus content of the two treatments were 30.28% and 22.40% higher than that of the control.

Keywords Tobacco root; Phosphate-dissolving bacteria; Identification; Soluble phosphorus content; Promoting effect on growth

磷是植物正常生長發(fā)育不可缺少的元素，在植物新陳代謝中起著重要作用。但土壤中可溶性磷的濃度一般很低，通常在1 mmol/L或更少[1]，因此不能滿足農(nóng)作物高產(chǎn)的需要。為提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)，農(nóng)戶往往每年施入大量磷肥，施入土壤后可溶性磷的大部分很快發(fā)生專性吸附和化學(xué)沉淀固定，轉(zhuǎn)變成植物難以吸收利用的無效態(tài)磷[2]。可見，土壤中被固定的無效態(tài)磷的分解、釋放對于提高土壤中的可溶性磷含量具有重要意義。

研究表明，解磷微生物在土壤磷循環(huán)系統(tǒng)中擔(dān)任重要角色，可將難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的可溶性磷，尤其是在植物根際，部分解磷微生物還起到一定的促生作用[3-6]。在自然環(huán)境中，植物根際土壤中存在大量具有不同解磷能力的微生物，如細菌、真菌和放線菌等，其中解磷細菌占1%～50%，而解磷真菌只占0.1%～0.5%[7];真菌、放線菌的解磷能力一般強于細菌[8]，但是，解磷真菌、放線菌的種類及數(shù)量遠不如解磷細菌[9]。這類微生物可以通過自身代謝產(chǎn)物或與其他生物協(xié)同溶解土壤中的難溶性無機磷，以增加土壤中有效磷的含量，從而提高土壤磷利用率[10， 11]，被稱為溶磷微生物 （PSM），這種溶磷現(xiàn)象稱為礦物溶磷 （MPS）現(xiàn)象。

具有解磷能力的細菌種類很多，主要有芽孢桿菌屬 （Bacillus）、伯克霍爾德菌屬 （Burkholderia）、假單胞菌屬 （Pseudomonas）、固氮菌屬 （Azotobacter）、埃希氏菌屬 （Escherichia）、土壤桿菌屬 （Agrobacterium）、腸桿菌屬 （Enterbacter）、沙雷氏菌屬 （Serratia）、黃桿菌屬 （Flavobacterium）、歐文氏菌屬 （Erwinia）等。

前期研究從煙株根際土壤中分離、篩選獲得一株高效溶解無機磷細菌菌株CT45-1，該菌株在Pikovaskaias（PVK）培養(yǎng)基平板上的解磷圈直徑 （D） 與菌落直徑 （d） 比值 （D/d）大于2.0，顯示出較強的解磷能力。本研究擬進一步探討菌株CT45-1的解磷能力，同時通過菌株的recA基因序列分析，確定該菌株的分類地位，以期為解磷微生物的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：菌株CT45-1分離自濰坊市昌樂縣鄌郚鎮(zhèn)煙田的根際土壤，通過初步篩選具有較好的溶解Ca3（PO4）2的能力。

培養(yǎng)基：NB培養(yǎng)基，用于細菌菌株的培養(yǎng);以Ca3（PO4）2作為唯一磷源的液體培養(yǎng)基NBRIP，用于供試菌株解磷能力定量測定[12]。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株CT45-1解磷能力測定 （1）種子液的制備：將菌株CT45-1在NB固體培養(yǎng)基上活化，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h;取單菌落接種于NB 液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液濃度至OD600值為1.0 左右，即制得種子液。

（2）液體培養(yǎng)：將種子液按1%接種量接種于100 mL的NBRIP無機磷液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)168 h，同時以接種等量無菌水作對照，每處理設(shè)3次重復(fù)。

（3）菌株解磷能力測定：按照魯如坤[13]研究方法制作磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，用鉬銻抗比色法[13]每24 h取樣測定培養(yǎng)液中可溶性磷含量。采用pH計（賽多利斯pH計，PB-10）測定pH值。

1.2.2 菌株CT45-1對煙株生長能力的影響 供試煙苗：NC55，6片真葉。

盆栽土壤取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)試驗田，過40目篩子后滅菌（160℃高壓滅菌12 h）使用。

盆栽土壤養(yǎng)分狀況：堿解氮67.00 mg/kg，有效磷120.70 mg/kg，速效鉀212.75 mg/kg，氯43.60 mg/kg，有機質(zhì)14.07 g/kg。pH=7.62。

供試菌株活化后在NB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h左右，離心 （6 000 r/min，15 min） 收集菌體，用無菌水懸浮離心，清洗2 次后稀釋到OD600為1.0（菌體濃度約為1.0×106 cfu/mL）。將生長一致的健壯煙苗移栽到花盆中（盆高15.7 cm，上沿口直徑12.9 cm，盆底直徑8.0 cm），每盆1棵煙苗，裝土樣2 kg左右，試驗共設(shè)3個處理：

CK： 400 mg （濃度200 mg/kg） Ca3（PO4）2 + 10 mL無菌水;

T1： 400 mg （濃度200 mg/kg） Ca3（PO4）2 + CT45-1菌液（OD600= 1.0）5 mL;

T2： 400 mg （濃度200 mg/kg） Ca3（PO4）2 + CT45-1菌液（OD600= 1.0）10 mL。

移栽后灌根接種，每15 d接種一次，每處理設(shè)5 次重復(fù)，45 d后收獲。測定植株的鮮重、干重、株高，用消煮鉬銻抗比色法測定植株全磷含量[13]。

1.2.3 菌株CT45-1的鑒定 形態(tài)特征觀察參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]的鑒定方法進行;分子生物學(xué)鑒定方法按照參考文獻[15]。recA基因擴增引物：BCR1 （5′-TGACCGCCGAGAAGAGCAA-3′）和BCR2 （5′-CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC-3′）。擴增反應(yīng)體系 （25 μL）：5 × PCR緩沖液2.5 μL，DNA模板 （50 ～ 100 ng/μL）1.0 μL，dNTPs （2.5 mmol/L）2 μL，正向引物BCR1 （10 μmol/L）1.0 μL，反向引物BCR2 （10 μmol/L）1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 17 μL。擴增程序：94℃ 3 min;94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環(huán);72℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增產(chǎn)物純化后，送上海生工生物工程股份有限公司進行測序，利用BLAST程序在GenBank中進行同源性比較，并用軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2003和DPS數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件進行分析，Duncans 新復(fù)極差法進行顯著性差異比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株CT45-1的解磷能力定量測定

菌株CT45-1在NBRIP液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)時，隨培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液中可溶性磷含量先急劇增加后降低并趨于穩(wěn)定，培養(yǎng)至24 h時可溶性磷含量急劇增加，且在48 h達到最大值（246.99 mg/L）;培養(yǎng)基初始pH值為6.9，培養(yǎng)過程中pH值均有所降低，在48 h時達到最低值（3.17），后上升并趨于穩(wěn)定（圖1）。

2.2 菌株CT45-1解磷促生效果測定

由表1可知，處理T1、T2的株高和鮮重均顯著高于對照，說明接種CT45-1可顯著促進煙苗的生長;處理T1、T2煙株的根、莖、葉的全磷含量分別為64.97 mg/g和69.15 mg/g，與對照（53.08 mg/g）相比，分別提高22.40%、30.28%，均達差異顯著水平（圖2）;土壤有效磷含量分別為234.10、245.93 mg/kg，而對照僅為202.15 mg/kg。結(jié)果表明菌株CT45-1對煙草具有較好的促生作用。

3 討論與結(jié)論

解磷微生物在土壤磷循環(huán)系統(tǒng)中擔(dān)任著重要角色，可將難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，從而提高磷肥的利用率。解磷微生物廣泛分布于土壤、水和植物體內(nèi)，但是，在自然條件下，這些解磷微生物的數(shù)量難以與生態(tài)系統(tǒng)中其他微生物競爭并發(fā)揮其活性，僅僅依靠自然條件的作用不足以釋放滿足植物生長發(fā)育所需的磷。因此，研究人員設(shè)想在自然條件下或生物體內(nèi)篩選到解磷菌株，制成菌劑后回接到土壤中以轉(zhuǎn)化出足量的有效磷[16， 17]。本研究從煙草根際篩選到一株高效解無機磷細菌菌株CT45-1，鉬銻抗比色法測定結(jié)果表明，該菌株對難溶性磷酸鹽Ca3（PO4）2具有較好的溶解效果;結(jié)合recA基因序列分析等方法，最終將菌株CT45-1 的分類地位明確為新洋蔥伯克霍爾德菌（B. cenocepacia）。

關(guān)于植物根際解磷細菌的種類及其解磷作用已有許多相關(guān)報道，其中不乏具有解磷效果較好的Burkholderia sp.，如Oliveira 等[18]從玉米根際分離得到的45株解磷微生物中，以Burkholderia sp.對磷酸鈣的溶解能力最強。但是，不同種類的解磷菌株或不同菌株之間的解磷能力有較大差異，如任嘉紅等[19]從南方紅豆杉根際土壤篩選出的幾株高效解磷細菌的解磷能力較好，有效磷含量高達647.67 mg/L;陶濤等[20]篩選到4 株溶解無機磷菌株，其溶磷量為102.77～174.08 mg/L;陳俊等[21]從紅樹林根際土壤中篩選出具有溶解磷酸三鈣的解磷細菌HN3-2，其解磷能力為90.95 mg/L。而本研究中CT45-1菌株可使培養(yǎng)液中可溶性磷含量達246.99 mg/L，表明此菌株溶解無機磷效果較好，有較好的應(yīng)用前景。

近年來，有許多關(guān)于利用解磷細菌促進作物生長的報道。Hameeda等[22]從堆肥中篩選出5株解磷細菌菌株，盆栽及大田試驗均表明，接種這些菌株可以提高玉米生物量;王婧[23]研究發(fā)現(xiàn)，桔黃假單胞菌株JD37接種番茄后，與對照組相比，其根長、苗高、鮮重、干重均有顯著提高，表明解磷細菌菌株JD37對番茄有較好的促生作用;Yu等[24]的研究表明，熒光假單胞菌顯著提高了植物株高、地上部干重，增加了核桃苗對氮、磷素的吸收;程寶森等[25]的研究顯示，接種解磷細菌的赤霞珠扦插苗株高、莖粗、地下干重、地上干重均比對照高，說明解磷細菌能較好地促進葡萄的生長。本研究探討了接種菌株CT45-1對煙苗生長的影響，盆栽試驗結(jié)果表明，接種該菌株能顯著提高供試煙苗的株高、鮮重，促進煙苗對磷素的吸收，接種不同濃度處理煙株的磷素比對照增加22.40%～30.28%，顯示出較好的應(yīng)用前景。

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