謝銀俠 王蔚然 程楠 許文濤

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100081）

核酸除了作為遺傳物質(zhì)的載體之外，還可以與一些天然存在或人工合成的小分子或離子結(jié)合，并發(fā)生構(gòu)象的改變；或是在這些靶分子的存在下，具有類似蛋白酶的催化活性，可以催化底物發(fā)生切割或連接反應(yīng)，這一類核酸稱為功能核酸（Functional nucleic acids，F(xiàn)NAs）［1-2］。FNAs 主要有兩類［3］，一類是與靶物質(zhì)結(jié)合時可發(fā)生構(gòu)象改變的適配體（Aptamer）；另一類是有酶催化活性的脫氧核酶（DNAzyme）和G-四鏈體（富含腺嘌呤的DNA所形成的四鏈體結(jié)構(gòu)）與氯化血紅素的復(fù)合物（Hemin/G4）。

近些年來，許多學(xué)者將FNAs用于構(gòu)建各種生物傳感器，包括光學(xué)生物傳感器［4-5］、壓電生物傳感器［6-7］和電化學(xué)生物傳感器［8-9］。其中，電化學(xué)功能核酸生物傳感器（Functional Nucleic Acids Elechemical Biosensors，F(xiàn)NAs-EB）由于其操作簡單，便攜性，靈敏度高，特異型強等優(yōu)點，并且在快速檢測和現(xiàn)場檢測方面具有廣闊的發(fā)展前景，近年來備受青睞。

FNAs-EB的構(gòu)建包括3個過程：信號識別、信號轉(zhuǎn)換和信號輸出［10］。信號識別主要是通過具有特異性識別能力的FNAs來實現(xiàn)；信號轉(zhuǎn)換主要是通過具有電活性的電信號分子實現(xiàn)的；信號輸出主要是通過電化學(xué)工作站和相關(guān)的分析設(shè)備來完成。具有氧化還原活性的電信號分子是FNAs-EB中必不可少的信號轉(zhuǎn)換元件。核酸在電極表面的狀態(tài)、是否與靶物質(zhì)結(jié)合、單鏈還是雙鏈都可以通過這些電信號分子的轉(zhuǎn)換變成電化學(xué)信號（電流、阻抗、電位、電勢）顯示出來（圖1）。因此，電信號分子的選擇對于每一個FNAs-EB的構(gòu)建都至關(guān)重要。常用的電化學(xué)檢測方法包括差示脈沖伏安法（Differential pulse voltammograms，DPV）、 方 波伏安法（Square wave voltammetry，SWV）、循環(huán)伏安法（Cyclic voltammograms，CV）、電化學(xué)阻抗圖譜法（Electrochemical impedance spectroscopy，EIS）、安培檢測法（Amperometric detection）、線性掃描伏安法（Linear sweep voltammetry，LSV）、計時庫侖法（Chronocoulometry）、 交 流 伏 安 法（Alternating current voltammetry，ACV）、陽極溶出伏安法（Anodic stripping voltammetry，ASV）等。

圖1 電信號的輸出形式

目前尚未發(fā)現(xiàn)有研究人員對于FNAs-EB中所使用的電信號分子進行總結(jié)或是分類，因此，本文將電信號分子按照其化學(xué)本質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進行分類，共分為5大類，分別介紹了每種電信號分子的產(chǎn)生電信號的方式和電信號分子的具體應(yīng)用，并對每種電信號分子的優(yōu)缺點進行了說明，最后對電信號分子的發(fā)展進行了展望。

FNAs-EB中的電信號分子主要包括染料類、金屬有機配合物類、納米材料類、類過氧化氫酶類和有機小分子類。每一大類下都有具體的分類，具體見表1。該表主要從電信號分子的使用情況、電化學(xué)檢測方法、出峰電位區(qū)間以及電信號輸出信號的方式對電信號分子進行匯總。

1 染料類電信號分子

染料類的電信號分子通常是一些具有多個苯環(huán)或者雜環(huán)的有機小分子，它們與DNA的相互作用主要是溝槽作用和嵌插作用。有平面結(jié)構(gòu)的多環(huán)芳烴（如吖啶類、吩噻嗪類、卟啉類等）可以以嵌插方式作用于DNA分子堿基對，還可以通過自身所帶的電荷與DNA發(fā)生靜電吸附作用［11］。但是，蘇木精與DNA間不是嵌插作用模式或溝槽作用模式、而是靜電作用模式［12］。

1.1 亞甲基藍

亞甲基藍（Methylene blue，MB），也稱次甲基藍，是一種芳香雜環(huán)化合物，屬吩噻嗪類染料，被用作化學(xué)指示劑、染料、生物染色劑和藥物使用。MB用作氧化還原指示劑通常用于電化學(xué)生物傳感器檢測中，其產(chǎn)生電信號的方式主要有3種。

把電信號分子標(biāo)記在核酸鏈上，通過核酸構(gòu)象的改變來調(diào)節(jié)亞甲基藍和電極表面距離，從而通過峰電流或者阻抗的變化來表示靶物質(zhì)的存在與否及靶物質(zhì)的多少。Mao等［13］將MB標(biāo)記在三核酸鏈上，靶物質(zhì)的存在將適配體分離，從而導(dǎo)致三核酸的形成，MB與電極表面的距離拉近而實現(xiàn)電流的增加，其檢測限（Limit of detection，LOD）是0.86 nmol/L。這種方式是MB最常見的使用方式，標(biāo)記方式簡單且通用，但是容易受到溶液環(huán)境的干擾且合成價格較貴。

研究表明，亞甲基藍與單雙鏈DNA（ssDNA/dsDNA）的結(jié)合能力不同，與dsDNA結(jié)合較多而與

ssDNA作用較少［14］。因此在利用FNAs進行檢測的過程中，可以通過從ssDNA到dsDNA的轉(zhuǎn)換或是dsDNA到ssDNA的轉(zhuǎn)換而引起的電信號的變化來進行電化學(xué)檢測。Yun等［15］利用鈾酰離子（UO2+）2的切割核酶和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR），當(dāng)靶物質(zhì)UO22+存在時，發(fā)生切割，裸露的ssDNA觸發(fā)HCR反應(yīng)，形成長雙鏈，在溶液中加入MB，MB與dsDNA結(jié)合，電化學(xué)檢測有明顯電流增加。這種方法雖然使用簡單，但是背景信號容易過高。

表1 電信號分子匯總表

圖2 染料類電信號分子

有研究人員將標(biāo)記在核酸鏈上的MB的通過酶切等作用釋放到溶液中，然后進行電化學(xué)方法檢測［16］。如Liu等［17］通過形成 G4把 MB 封閉到納米介孔二氧化硅中，在堿性環(huán)境中G4結(jié)構(gòu)中打開，釋放MB到溶液中，然后進行電化學(xué)檢測，實現(xiàn)對甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測。該方法使用較少。

1.2 結(jié)晶紫

結(jié)晶紫（Crystal violet，CV）是三苯甲烷染料家族的成員，已被廣泛用于紡織品，紙張，食品和藥物的染色，同時也是生化調(diào)查中重要的生物染色劑和探針。有研究發(fā)現(xiàn)CV具有與帶負(fù)電荷的磷酸骨架和G4環(huán)的氫鍵和陽離子-偶極相互作用的能力。Kong等［18］則進一步證明CV對G4的選擇性比dsDNA或ssDNA顯著。Li等［19］設(shè)計了一個利用Pb2+誘導(dǎo)富含G的序列形成G4結(jié)構(gòu)，當(dāng)CV嵌入到G4結(jié)構(gòu)中時，發(fā)生CV的還原，導(dǎo)致電流增強，從而實現(xiàn)對Pb2+的檢測，其檢測限為0.4 nmol/L。CV在功能核酸介導(dǎo)的電化學(xué)生物傳感器中使用較少，可能由于其使用范圍太窄。

1.3 乙基綠

乙基綠（Ethyl Green，EG）也屬三苯甲烷家族，是一種染料，金黃色閃光結(jié)晶，可溶于水和乙醇，由CV加入乙基制成。有研究的光譜和電化學(xué)結(jié)果表明，DNA和EG的主要相互作用模式是選擇性條件下的靜電結(jié)合［20］。Maryam等［21］利用EG作為電信號物質(zhì)基于C-Ag+-C錯配檢測Ag+。當(dāng)Ag+存在的時候，富含C的核酸序列與之結(jié)合，使得原本與核酸鏈結(jié)合的EG部分脫去而導(dǎo)致峰電流的降低，從而實現(xiàn)對Ag+的檢測，檢測限是26 pmol/L。該方法是一個陽性組信號減小的模型，這對于其線性檢測范圍的上限是一個很大的限制。

1.4 蘇木精

蘇木精（Hematoxylin）是一種天然染料，可以和核酸鏈結(jié)合用于電化學(xué)生物傳感器中。蘇木精與單雙鏈DNA的結(jié)合能力不同，但都是與DNA鏈的大溝穴結(jié)合且更傾向于和dsDNA結(jié)合，其結(jié)合的差異性可以通過電信號的差異顯示。Aghili等［22］利用蘇木精作為電信號分子設(shè)計了一個檢轉(zhuǎn)基因的電化學(xué)生物傳感器，該方法實現(xiàn)了較高的靈敏度，其檢測限是13.0×10-15mol/L。

1.5 Hoechst 33258

Hoechst 33258，是一種熒光染料，常用于細胞中的DNA染色，可與DNA鏈中富含腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）的區(qū)域，與DNA中的小溝穴結(jié)合。有研究人員把Hoechst 33258用于電化學(xué)生物傳感器中作為電信號分子［23］，Ahmed等［24］基于環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增反應(yīng)構(gòu)建了檢測轉(zhuǎn)基因玉米的電化學(xué)傳感器，利用Hoechst 33258的氧化產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)電信號的產(chǎn)生。Hoechst 33258在電化學(xué)生物傳感器中應(yīng)用較少，且多用于轉(zhuǎn)基因的檢測。

1.6 尼羅藍

尼羅藍（Nile blue，NB），又稱耐爾藍，尼羅藍硫酸鹽。綠色結(jié)晶性粉末，具有金屬光澤。溶于熱水呈藍色，微溶于冷水和乙醇，常用于配制酸堿混合指示劑，也用作生物染色劑。NB是具有雜環(huán)平面和剛性結(jié)構(gòu)的陽離子吩惡嗪染料，其平面疏水性吩惡嗪部分會促進NB嵌入到DNA螺旋的相對非平面內(nèi)部，其結(jié)合常數(shù)約10-3。NB與ssDNA的結(jié)合是通過靜電相互作用，而與dsDNA的結(jié)合是嵌入和靜電相互作用的雙重作用，根據(jù)這種結(jié)合的差異性，可以把 NB 用于 FNAs-EB 中［25］。Alipour等［26］利用NB作為電信號分子用于檢丙型肝炎病毒，NB與靶分子和探針?biāo)纬傻膁sDNA結(jié)合，導(dǎo)致NB在dsDNA上積累而實現(xiàn)電信號的增加。由于NB與單雙鏈均可結(jié)合，這種方法的背景信號會比較高。

2 金屬有機配合物類電信號分子

金屬有機配合物是指由金屬原子或離子作為中心原子或中心離子與有機配體完全或部分由配位鍵結(jié)合形成的化合物［27］。過渡金屬配合物具有低毒性，易制備，化學(xué)穩(wěn)定性好，氧化還原信號強，結(jié)構(gòu)靈活性高等優(yōu)點，因此，金屬基配合物經(jīng)常被設(shè)計用作電化學(xué)DNA雜交指示劑。對于帶負(fù)電的金屬有機配合物，它與DNA的相互作用主要是與DNA的帶負(fù)電的磷酸骨架之間的靜電排斥作用力［28-29］，如［Fe（CN）6］3-/4-。而帶正電的金屬有機配合物與DNA的相互作用方式主要是外層的靜電作用。常用于FNAs-EB的過渡金屬有機配合物主要包括：鐵類有機配合物、釕類有機配合物、銅類有機配合物、鋨類有機配合物、鈷類有機配合物等。

2.1 鐵類有機配合物

2.1.1 鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀 鐵氰化鉀{K3［Fe（CN）6］}，別名赤血鹽，深紅色或紅色單斜晶系柱狀結(jié)晶或粉末。亞鐵氰化鉀K4［Fe（CN）6］俗稱黃血鹽，是化學(xué)式為K4［Fe（CN）6］·3H2O的配位化合物。室溫下為檸檬黃色單斜晶體，于沸點分解。兩者均可溶于水。K3［Fe（CN）6］和 K4［Fe（CN）6］的酸根離子兩者本身就是一組可以發(fā)生半個氧化還原反應(yīng)的離子對，其在FNAs-EB中的應(yīng)用主要是用于EIS檢測中，通過檢測帶負(fù)電的［Fe（CN）6］3-/4-離子和帶負(fù)電的核酸的磷酸骨架的靜電排斥作用的阻抗值，然后根據(jù)EIS圖譜判斷電極表面的核酸修飾情況。Huang等［30］構(gòu)建了一個基于腺嘌呤納米線的Hg2+電化學(xué)生物傳感器，并用含［Fe（CN）6］3-/4-的溶液對核酸修飾的電極進行表征，而Cai等［31］構(gòu)建了一個基于DNA水凝膠和切割核酶介導(dǎo)的靶循環(huán)及HCR檢Hg2+的傳感器，并用EIS直接進行定性和定量檢測，并獲得線性檢測范圍和檢測限。

圖3 金屬有機配合物類電信號分子

2.1.2 二茂鐵及其衍生物 二茂鐵（Ferrocene，F(xiàn)c）也稱雙環(huán)茂二烯合鐵，是一種具有芳香族性質(zhì)的過渡金屬有機化合物。常溫下為橙黃色粉末，有樟腦氣味。Fc由于具有2個可以自由旋轉(zhuǎn)的環(huán)戊二烯環(huán)，能與DNA堿基產(chǎn)生疏水、堆積作用而發(fā)生溝面結(jié)合［32］。Fc作為電信號分子其產(chǎn)生電信號的方式主要是被標(biāo)記在核酸鏈的末端或者莖環(huán)核酸的一端，通過切割核酶的切割作用或是核酸鏈之間的相互作用改變Fc與電極表面之間的距離，從而實現(xiàn)電信號的改變，達到檢測的目的。Wei等［33］基于三核酸結(jié)構(gòu)和抗原抗體雜交構(gòu)建了一個檢地高辛抗體的生物傳感器，抗原抗體結(jié)合之后，三核酸結(jié)構(gòu)打開，形成莖環(huán)，F(xiàn)c與電極之間距離減小，電流增加。Zhang等［34］基于Pb2+的切割核酶和發(fā)卡的結(jié)構(gòu)設(shè)計了一個檢Pb2+的生物傳感器，當(dāng)靶物質(zhì)Pb2+存在時，發(fā)卡的一部分被切割，F(xiàn)c遠離電極，電流減小，從而實現(xiàn)對Pb2+的檢測，檢測限是0.25 nmol/L。Fc作為電信號分子在FNAs-EB中使用較多，和MB一樣都是經(jīng)典的電信號分子，且會跟MB結(jié)合用在比率電化學(xué)傳感器中［35-37］，雙電信號分子的結(jié)合使用相當(dāng)于引進了內(nèi)參，排除了背景信號的干擾。

2.2 釕類有機配合物

2.2.1 氯化六胺合釕 氯化六胺合釕（［Ru（NH3）6］Cl3）作為電信號分子主要是［Ru（NH3）6］3+起作用，其與DNA作用的主要方式是嵌入作用［38］。［Ru（NH3）6］3+只與dsDNA結(jié)合而不與ssDNA結(jié)合，它與DNA序列中帶負(fù)電的磷酸骨架靜電結(jié)合之后通過電化學(xué)方法（DPV、CV等）檢測電信號。Cui等［39］基于金納米粒子和發(fā)卡DNA構(gòu)建了檢DNA的電化學(xué)生物傳感器，當(dāng)靶序列存在的時候，將連有發(fā)卡的金納米粒子連接在電極表面，基于［Ru（NH3）6］3+進行DPV檢測，檢測限為1×10-15mol/L。值得一提的是DNA磷酸骨架的結(jié)合會受到檢測溶液中電介質(zhì)的影響，尤其是其中的陽離子濃度，［Ru（NH3）6］3+本身的濃度也會影響最終檢測的電信號，所以實驗過程中需要優(yōu)化［40］。

2.2.2 1，10-菲咯啉二氯化釕 1，10-菲咯啉二氯化釕{［Ru（phen）3］Cl2}在電化學(xué)檢測中的應(yīng)用主要是基于帶正電的釕配合物{［Ru（phen）3］2+}與帶負(fù)電的磷酸骨架之間的靜電吸引作用，由于DNA的單雙鏈的陰離子密度不同，可以結(jié)合的釕配合物分子的數(shù)量也不同，從而通過檢測結(jié)合在核酸鏈上的釕配合物分子的電子傳遞情況，結(jié)合的釕配合物分子越多，峰電流越大。Huang等［41］利用石墨烯，金納米棒及聚硫堇的復(fù)合物和超級三明治的放大方法設(shè)計了一個檢人乳頭瘤病毒DNA的電化學(xué)生物傳感器，當(dāng)靶物質(zhì)存在的時候引發(fā)超級三明治的發(fā)生，產(chǎn)生長雙鏈，［Ru（phen）3］2+與長雙鏈結(jié)合，有明顯的電流增加。Liu等［42］基于劈裂適配體設(shè)計了一個檢ATP的電化學(xué)生物傳感器，當(dāng)靶物質(zhì)ATP存在的時候形成雙鏈，［Ru（phen）3］2+與長雙鏈結(jié)合引起電流的增加。這種與單雙鏈均可結(jié)合的電信號分子存在一個共性的問題，即背景信號過高。

2.3 銅類有機配合物

銅（Cu）是價格相對低廉，化學(xué)穩(wěn)定性好和低毒性的過渡金屬，并且在電化學(xué)方面，Cu2+表現(xiàn)出合適的氧化還原電位，高的電子轉(zhuǎn)移可逆性（Cu2+/Cu+）和強的響應(yīng)信號。因此，它常常被選作電化學(xué)信號源，與某些功能性配體結(jié)合，然后作為生物傳感應(yīng)用的電化學(xué)探針。

2.3.1 4'-氨基苯并-18-冠醚-6-Cu2+冠醚具有與金屬離子選擇性絡(luò)合的優(yōu)異能力，因此經(jīng)常用作選擇性測定各種金屬離子的功能材料。18-冠醚-6是重要的主體冠醚，其空腔尺寸與一系列金屬離子的大小相當(dāng)，在溶液和固態(tài)中形成穩(wěn)定的“金屬空腔”型絡(luò)合物。Zhan等［43］設(shè)計了一個以4'-氨基苯并-18-冠醚-6銅（II）配合物（AbC-Cu2+）作為電信號分子的電化學(xué)生物傳感器檢測花椰菜花葉病毒啟動子（CaMV 35s），冠醚環(huán)通過羧基與氨基之間形成共價鍵連接至莖環(huán)核酸末端，而Cu2+與環(huán)之間通過配位鍵結(jié)合，此時有一個較高的電流信號產(chǎn)生，當(dāng)莖環(huán)被靶物質(zhì)打開后，電流信號降低，兩者之間的電子轉(zhuǎn)移是通過Cu2+/ Cu+產(chǎn)生的。該方法實現(xiàn)了一個較低的靈敏度，檢測限是0.060 pmol/L。這種電信號分子對于檢核酸的電化學(xué)生物傳感器具有通用性。

2.3.2 三聚氰胺-Cu2+作為具有1，3，5-三嗪骨架的氰胺三聚物，三聚氰胺（Mel）具有非常好的穩(wěn)定性和較差的電活性。即使在強堿性條件下，由于氨基的電氧化帶來的電化學(xué)響應(yīng)也非常弱，因此不適用于Mel的電化學(xué)分析。而Cu2+的加入可以改善其電活性，由于Mel的pKa約為6，所以中性或弱堿性條件適合于通過將亞銅離子與中性Mel配位而形成Cu-Mel絡(luò)合物。Zhu等［44］利用Cu2+與三聚氰胺的結(jié)合設(shè)計了一種可以快速檢測污染的奶制品中三聚氰胺含量的濃度。當(dāng)Mel的濃度大于Cu2+時，會形成 CuCl2（Mel）2H2O配合物；當(dāng)Cu2+濃度小于Mel的濃度時，會形成CuCl2Mel（H2O）2配合物。該檢測體系實現(xiàn)了檢測限為7.92 nmol/L。Wang等［45］基于莖環(huán)結(jié)構(gòu)和Mel-Cu2+作為電信號物質(zhì)以及金納米粒子設(shè)計了檢測核酸序列的電化學(xué)生物傳感器，檢測限低至1.2×10-19mol/L。但是這種針對某種特殊非法添加物設(shè)計的檢測方法不具有通用性。

2.3.3 L-天門冬氨酸-Cu2+Cu2+與很多氨基酸具有很強的結(jié)合能力，Wang等［46］基于Cu2+與L-天門冬氨酸（L-Asp）結(jié)合和分子信標(biāo)設(shè)計了一個檢測DNA的電化學(xué)生物傳感器，電信號的產(chǎn)生主要來自Cu2+/Cu+之間的氧化還原反應(yīng)，其檢測限最低可達到0.17 f mol/L。這種電信號產(chǎn)生的方式也可用于其他類似的電化學(xué)生物傳感器中。

2.4 鋨類有機配合物

四氧化鋨聯(lián)吡啶［OsO4（bipy）］不與完全互補的雙鏈結(jié)合，且當(dāng)四氧化鋨聯(lián)吡啶［OsO4（bipy）］與ssDNA結(jié)合時，該ssDNA無法和其互補鏈結(jié)合，因此可用于檢測單堿基錯配。Mix等［47］利用［OsO4（bipy）］作為電信號分子檢測實際轉(zhuǎn)基因玉米樣品，可以檢測到混合樣品中0.6%的轉(zhuǎn)基因樣品。［OsO4（bipy）］作為電信號分子使用較少，且多用于轉(zhuǎn)基因的檢測。這種與單鏈結(jié)合而不與完全互補的雙鏈結(jié)合的電信號分子比較少見，適合用于關(guān)閉型的生物傳感器的構(gòu)建。

2.5 鈷類有機配合物

1，10-鄰菲咯啉合鈷［Co（phen）3］3+被用作電化學(xué)傳感器的電信號分子，原理與［Ru（phen）3］2+類似。Wang等［48］利用［Co（phen）3］3+作為電信號分子構(gòu)建了檢測轉(zhuǎn)基因大豆的電化學(xué)傳感器，并實現(xiàn)了1.0×10-9mol/L的檢測限。同樣，以［Co（phen）3］3+作為電信號分子設(shè)計的功能核酸電化學(xué)生物傳感器的背景信號會比較高。

3 納米材料類電信號分子

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸（0.1-100 nm）或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料。納米材料類的電信號分子的一個主要結(jié)構(gòu)特征就是具有納米級的尺度，因此具有量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)。納米材料類的電信號分子的電子轉(zhuǎn)移效率相對于其他電信號分子會高很多，因此基于納米材料類的電信號分子的電化學(xué)生物傳感器具有很高的靈敏度。

3.1 量子點

量子點（Quantum dots，QDs）是一種納米材料，電化學(xué)生物傳感器中最常用的是硒化鎘（CdSe）QD。QDs作為電信號分子主要用來標(biāo)記核酸鏈，當(dāng)識別和雜交過程結(jié)束之后，用硝酸將標(biāo)記在核酸鏈上的量子點溶解出Cd2+，再采用電化學(xué)方法檢測Cd2+的峰電流，根據(jù)Cd2+的濃度與靶物質(zhì)的關(guān)系得出靶物質(zhì)的濃度［49］。Tang等［50］在磁珠表面修飾了Pb2+的切割核酶序列，并利用滾環(huán)擴增反應(yīng)和標(biāo)記有CdS QDs的信號探針設(shè)計了檢Pb2+的電化學(xué)生物傳感器，當(dāng)Pb2+存在時發(fā)生切割從而引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)，擴增出來的重復(fù)序列與CdS QDs信號探針互補，再利用磁珠分離，硝酸溶解之后進行電化學(xué)檢測，其檢測限可達7.8 pmol/L。Yang等［51］基于Ni2+的切割核酶和CdSe QDs檢測Ni2+，檢測限是6.67 nmol/L。QDs作為電信號分子具有通用性，且背景信號不高，具有很大的應(yīng)用前景。

圖4 納米材料類電信號分子

3.2 氧化石墨烯及其復(fù)合物

氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）是石墨烯的氧化物，氧化后其表面含氧官能團增多而使其性質(zhì)較石墨烯更加活潑。GO的親水性很強，而且在水中有良好的分散性。GO和還原性氧化石墨烯（Reduced graphene oxide，rGO）具有高導(dǎo)電性，生物兼容性和表面修飾功能。GO可與ssDNA通過π-π作用結(jié)合，而對于雙鏈DNA沒有該作用。GO中具有一些可還原的基團，Park等［52］把GO作為電信號物質(zhì)，通過測量電化學(xué)還原GO的過程中產(chǎn)生的電流來檢測Hg2+濃度。但是GO和rGO更多的是與金納米粒子（AuNPs）等納米材料結(jié)合使用，用于電極的修飾，通過增加核酸探針的搭載量來實現(xiàn)信號放大的作用［53-55］。使用較多，但是修飾的過程復(fù)雜且價格較高，不利于普及。

3.3 金屬有機框架

金 屬 有 機 框 架（Metal-organic frameworks，MOFs），即金屬-有機配位聚合物，它是通過配位鍵、共價鍵和分子間弱鍵（π-π堆積、范德華力、氫鍵及其他靜電作用等）將金屬離子與有機配體自組裝形成的具有無限規(guī)整并無限擴展的周期性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的晶體材料［56］。該類配合物有著豐富的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，較高的比表面積，金屬離子與配體間既有較強的成鍵作用又包含分子間弱相互作用，既整合了金屬中心的導(dǎo)電、熒光、氧化還原和催化等特性，又有著有機分子材料優(yōu)良的溶解性能、柔性及成型性能。MOFs是一種具有良好的穩(wěn)定性，巨大的孔隙率和比表面積的納米材料，在氣體儲存，藥物輸送和傳感器方面受到極大的關(guān)注。由于MOFs具有內(nèi)在的過氧化物酶催化活性，因此在電化學(xué)生物傳感器中也有應(yīng)用。Xu等［57］基于以Fe制備的MOFs，即MIL-101（Fe）和Pb2+適配體構(gòu)建了一個Pb2+電化學(xué)生物傳感器，MIL-101（Fe）作為電信號分子，將雙金屬銀鉑納米粒子（AgPtNPs）與之聯(lián)用，增加了其電導(dǎo)率和電催化活性，靈敏度達到0.032 pmol/L。MOFs雖具有酶的活性有利于提高靈敏度，但是其合成過程較為復(fù)雜，且修飾的過程的表征也很復(fù)雜，因此不適于常規(guī)使用。

3.4 銀納米粒子

基于銀納米粒子（AgNPs）的功能核酸電化學(xué)生物傳感器其電信號的產(chǎn)生主要是源于 Ag/AgCl之間的反應(yīng)。Tang等［58］利用在羥胺存在下T-Hg2+-T的結(jié)合將氯金酸還原，并生成金汞齊，而金汞齊可以將Ag+還原并形成AgNPs，增強其電化學(xué)信號，基于此設(shè)計的Hg2+電化學(xué)生物傳感器的檢測限達到0.002 nmol/L并且具有很高的特異性。Miao等［59］基于正四面體DNA和莖環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)建了一個檢miRNA的電化學(xué)傳感器，并用AgNPs標(biāo)記在信號探針上，當(dāng)靶物質(zhì)存在時，打開的莖環(huán)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致體系的電化學(xué)阻抗顯著增加，但是由于AgNPs的存在，與AgCl電極之間的氧化還原反應(yīng)使得阻抗大幅度降低，從而實現(xiàn)高靈敏度檢測miRNA，其檢測限可達0.4 fmol/L。AgNPs作為電信號分子其背景信號低，且修飾過程相對于其他的納米材料較為簡單。

4 類過氧化氫酶類電信號分子

類過氧化氫酶類的電信號分子的一個主要特征就是具有氯化血紅素（Hemin）和富含腺嘌呤的核酸鏈形成的四聯(lián)體結(jié)構(gòu)（G4）組成的復(fù)合物。當(dāng)Hemin嵌入G4結(jié)構(gòu)中，該復(fù)合物（hemin /G4）會具有辣根過氧化物酶的催化活性［60］。把hemin /G4與一些底物結(jié)合會觸發(fā)一些氧化還原反應(yīng)發(fā)生，并發(fā)生電子的轉(zhuǎn)移。

圖5 hemin/G4的形成過程

4.1 Hemin /G4+H2O2 +苯胺

苯胺（An）在hemin /G4的催化活性下在H2O2溶液中即使在溫和條件下也會形成聚苯胺（PAn）。PAn是一種有用的導(dǎo)電聚合物，其優(yōu)良的導(dǎo)電性和氧化還原性在電催化和電化學(xué)傳感器領(lǐng)域得到了廣泛的研究。Zhu等［61］通過An到PAn的反應(yīng)將PAn沉積到電極表面形成納米膜，吸附核酸至電極表面，之后進行電催化反應(yīng)以此來檢測靶DNA。Zhang等［62］基于HCR和苯胺和hemin /G4形成的長納米線構(gòu)建了一個檢Pb2+的電化學(xué)生物傳感器，其檢測限可達32 pmol/L。

4.2 Hemin /G4+H2O2 +硫堇

硫堇（Thionine，TH）是一種芳香族氧化還原染料，由于其獨特的優(yōu)勢，如高水溶性，可逆的電化學(xué)響應(yīng)和合適的氧化還原電位，已被廣泛用作電分析化學(xué)領(lǐng)域的電活性探針。Gao等［63］利用硫堇和Pb2+適配體構(gòu)建了Pb2+電化學(xué)傳感器，并利用硫堇與石墨烯的結(jié)合放大了電信號，因?qū)崿F(xiàn)了較高的靈敏度，其檢測限可達3.2×10-14mol/L，且具有良好的重建性和選擇性。Zhou等［64］基于Pb2+的脫氧核酶和hemin/G4及硫堇構(gòu)建了一個檢Pb2+的電化學(xué)傳感器。Hemin/G4復(fù)合物具有過氧化物酶活性，可以催化硫堇的氧化態(tài)與還原態(tài)之間的轉(zhuǎn)換從而產(chǎn)生電子的轉(zhuǎn)移，他們還通過金鈀雙金屬納米粒子進行信號放大，而實現(xiàn)靈敏度的提高。

4.3 Hemin /G4

除了上述的一些與G4/hemin聯(lián)用的電信號分子之外，由于hemin本身也存在電子轉(zhuǎn)移，因此有研究人員僅用G4/hemin復(fù)合物所產(chǎn)生檢測一些靶生物分子（凝血酶，miRNA等）［65-66］。

這些基于Hemin /G4所構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器，首先有個問題就是hemin本身的非特異性吸附會導(dǎo)致背景信號過高；其次，若結(jié)合了其他底物的氧化還原反應(yīng)，底物本身的特異性吸附也會影響實驗結(jié)果。

5 有機小分子類電信號分子

有機小分子類的電信號分子是基于上述4種電信號分子分類之后，將不屬于上述4類的電信號分子歸為一類，因此它們之間沒有一個共同的特征。

5.1 蒽醌類物質(zhì)

蒽醌（Anthraquinone，AQ）是經(jīng)常用于生物分子電化學(xué)標(biāo)記的氧化還原活性分子。通過直接連接或通過乙炔或更長的柔性連接物連接的多種AQ衍生物被多次用于嘌呤或嘧啶核苷的標(biāo)記，甚至通過亞磷酰胺合成化學(xué)摻入到DNA中以研究通過DNA的電荷轉(zhuǎn)移［67］。

Zhang等［68］用 AQ的衍生物，蒽醌 -2，6-二磺酸二鈉（Anthraquinone-2，6-disulfonate，AQDS）作為電活性物質(zhì)，結(jié)合金納米簇設(shè)計了檢測痕量汞的電化學(xué)生物傳感器。AQDS具有獨特的蒽環(huán)結(jié)構(gòu)，可以嵌入dsDNA中，電化學(xué)檢測中有醌/氫醌氧化還原電對的可逆雙電子轉(zhuǎn)移過程。Zhou等［69］也利用AQDS 和多孔納米金設(shè)計了檢測Ag+的電化學(xué)生物傳感器。

蒽醌-2-磺酸鈉鹽（AQMS）作為AQ的衍生物，也作為電活性物質(zhì)被用在電化學(xué)生物傳感器中。Bala等［70］把MB和AQMS作為電信號分子分別標(biāo)記在核酸上用于檢Pb2+，發(fā)現(xiàn)陰離子嵌入劑的檢測效果要比陽離子嵌入劑MB的檢測效果好，這是因為dsDNA和ssDNA都帶有負(fù)電荷，與陽離子嵌入劑會因為靜電吸引作用結(jié)合。而陽離子嵌入劑和dsDNA之間的相互作用是靜電吸引，嵌入和可能的物理吸附的協(xié)同作用的結(jié)果。因此，會有很高的背景信號。特別是當(dāng)靜電引力成為相互作用中的主導(dǎo)力時，很難區(qū)分dsDNA和ssDNA。

值得一提的是AQDS屬于陰離子嵌入劑，其產(chǎn)生的背景信號要比陽離子嵌入劑低。由于AQ與DNA都是帶負(fù)電的分子，因此AQ的嵌入過程很慢，但是高鹽濃度的緩沖液可以暫時屏蔽其靜電排斥而加快其嵌入。

圖6 蒽醌類電信號分子

5.2 α-環(huán)糊精和4-［4-（二甲基氨基）苯偶氮］苯甲酸

環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD），又稱為環(huán)狀直鏈淀粉，它是由6-8個D-葡萄糖以α-1，4-糖苷鍵連接成環(huán)狀的低聚糖，分別稱為α、β或γ-環(huán)糊精。環(huán)糊精分子呈環(huán)形圓筒狀。由于具有“內(nèi)疏水，外親水”的特殊分子結(jié)構(gòu)，能作為“宿主”包絡(luò)眾多不同種類的“客體”化合物，形成包絡(luò)物。目前已經(jīng)發(fā)展成為超分子化學(xué)最重要的主體。dabcyl是最常用的深色淬滅劑之一，用于標(biāo)記寡核苷酸和多肽。它所形成的偶聯(lián)物廣泛地用于制備診斷探針，例如分子標(biāo)記和蛋白酶底物。Fan等［71］利用α-CD與dabcyl的分子識別作用和PbS納米粒子構(gòu)建了電化學(xué)生物傳感器來檢測DNA，并具有良好的選擇性，可識別單堿基錯配。這種基于主客體識別應(yīng)用于FNAs-EB中的研究較少，而CD可與很多分子實現(xiàn)主客體識別，因此具有很廣闊的應(yīng)用前景。

6 總結(jié)與展望

本文從電信號分子的化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的角度把電信號分子分為5大類，包括染料類、金屬有機配合物類、納米材料類、類過氧化氫酶類和有機小分子類，并對每一大類下的不同電信號分子的電信號的產(chǎn)生方式和應(yīng)用以及優(yōu)缺點進行了闡述。對于染料類的電信號分子而言，不僅具有電活性，而且具有熒光特性，這對于發(fā)展同時具有電信號和熒光信號這兩種輸出信號的生物傳感器方面具有應(yīng)用前景，但是目前染料類電信號分子使用較多的只有MB。對于金屬有機配合物類的電信號分子，根據(jù)其化學(xué)組成而言仍有很多過渡金屬可被發(fā)展為電信號分子，目前使用較多的是［Fe（CN）6］3-/4-和［Ru（NH3）6］3+，金屬有機配合物類的電信號分子有個明顯的優(yōu)點是無需標(biāo)記，只需要溶于溶液即可。納米材料的電信號分子由于具有良好的電子傳遞效率頗受關(guān)注，但是其合成復(fù)雜且成本較高。類過氧化氫酶類的電信號分子在使用過程中容易出現(xiàn)電極對于hemin的非特異性吸附，但是酶底物的存在可以放大電信號，因此使用也較多。有機小分子類的電信號分子還有很多，基于環(huán)糊精和dabcyl的電化學(xué)傳感器的成功構(gòu)建也說明超分子化學(xué)在新的電信號分子發(fā)現(xiàn)具有很大的發(fā)展前景。

電信號分子的選擇直接關(guān)系到FNAs-EB的檢測限的高低、線性檢測范圍的大小、成本及應(yīng)用領(lǐng)域。因此，電信號分子的發(fā)展對于FNAs-EB發(fā)展具有很重要的推動和促進作用。目前文獻中所提到的電信號分子都存在各種各樣的問題而導(dǎo)致其不能應(yīng)用在實際生活中的現(xiàn)場檢測、實時檢測以及快速檢測。對于那些與單雙鏈均可結(jié)合的電信號分子將其用于構(gòu)建FNAs-EB，均存在背景信號過高的問題；對于基于hemin/G4的電信號分子，hemin本身的非特異性吸附問題所帶來的電信號對于陽性組本身的電信號干擾太大也是目前一個亟待解決的問題；對于一些小眾的電信號分子（三聚氰胺-Cu2+、CV等），它們使用的局限性導(dǎo)致其通用性有限。這些問題目前是構(gòu)建FNAs-EB亟待解決的問題，解決這些問題對于功能核酸介導(dǎo)的電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展將是一個很大的突破。

目前，基于功能核酸的電化學(xué)生物傳感器存在著一個很大的問題就是核酸在界面修飾的不穩(wěn)定性問題，這種不穩(wěn)定性主要來源于非均相界面的特異性吸附導(dǎo)致無法確保核酸鏈在電極表面處于直立狀態(tài)；再者，ssDNA是非剛性的結(jié)構(gòu)，在電極表面的形態(tài)也具有不確定性。這些不確定性導(dǎo)致產(chǎn)生的電信號的不穩(wěn)定性，同時也導(dǎo)致所構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器不具有可重復(fù)性。解決電化學(xué)的穩(wěn)定性問題對于電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展將是一個質(zhì)的飛躍。很多學(xué)者通過改變在電極表面固定的核酸的結(jié)構(gòu)來提高電極的穩(wěn)定性，如Li等［72］把具有剛性結(jié)構(gòu)的DNA納米結(jié)構(gòu)（正四面體DNA）固定在電極表面以降低電極表面的非特異性吸附和提高電極的穩(wěn)定性，實驗結(jié)果表明電極表面固定正四面體DNA可以降低背景信號。電信號分子同樣是FNAs-EB的重要組成部分，能否通過對于電信號分子進行化學(xué)修飾來改善電極的穩(wěn)定性也是我們需要探究的地方。

目前文獻中所提到的電信號分子既有無機分子，又有有機分子；既有普通材料又有納米材料。電信號分子的多樣性為電化學(xué)生物傳感器的多重檢測提供了可能，可以利用不同電信號分子的出峰電位不同開發(fā)用于多重檢測的電化學(xué)生物傳感器，也可以利用電信號分子產(chǎn)生電信號的方式的差異性來進行多重傳感設(shè)計。

微型電極是近些年來比較熱門的一個話題，微型電極的發(fā)展對于發(fā)展用于快速檢測、現(xiàn)場檢測的電化學(xué)生物傳感器至關(guān)重要。而微型電極由于其“微”的特性，其表面可以修飾的核酸的量便受到了限制，因此電極材料就必須選擇比表面積大且能夠更多地搭載核酸的材料，因此多孔的納米材料（石墨烯或氧化石墨烯等）就成為一個優(yōu)先選擇。除了電極材料之外，選擇適用于微型電極的電信號分子也是增強其電信號提高靈敏度的一種方法。微型電極的發(fā)展是將電化學(xué)生物傳感器用于高通量檢測、細胞檢測或體內(nèi)檢測前提。因此，尋找更適合微型電極的電信號分子至關(guān)重要。

目前，關(guān)于電信號分子的專門研究仍較少，而且很多具有氧化還原電活性的信號分子尚未被應(yīng)用在電化學(xué)中。很多過渡金屬離子具有多種價態(tài)，將其與環(huán)狀分子（如環(huán)糊精）結(jié)合構(gòu)建新的電信號分子是有可能的；對于一些有顏色變化的氧化還原反應(yīng)，如果可以將其用作電信號分子，可實現(xiàn)可視化與電信號的兩種輸出方式；許多金屬有機配合物離子尚未被應(yīng)用于電化學(xué)領(lǐng)域中，篩選出具有電化學(xué)活性的其他金屬有機配合物離子作為電信號分子也有可能。電信號的產(chǎn)生主要是發(fā)生了氧化還原反應(yīng)，因此，那些可發(fā)生氧化還原反應(yīng)且可以與核酸作用的化學(xué)小分子都有可能應(yīng)用在FNAs-EB中，這在發(fā)展低成本的電化學(xué)生物傳感器方面具有廣闊前景。