謝盼 葉倩 劉旭平 譚文松

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

近年來，基于動物細胞培養(yǎng)技術的流感疫苗生產已經成為主流。與傳統(tǒng)的雞胚生產工藝相比，細胞培養(yǎng)生產工藝在流感爆發(fā)時操作更靈活，并且可快速大規(guī)模培養(yǎng)以應對SPF（無特定病原體）雞蛋供應不足的問題［1-3］。然而，隨著流感的頻發(fā)，流感疫苗的需求量越來越大，同時現有細胞培養(yǎng)生產工藝產能相對低下，導致市場供不應求。因此，當下提高流感病毒在細胞中的擴增效率的研究工作尤為迫切。在動物細胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的開發(fā)和優(yōu)化是促進細胞生長、維持和目的產品生產等的核心技術和研究熱點［4-6］。

在基于細胞培養(yǎng)的流感疫苗生產工藝中，培養(yǎng)基是細胞生長和維持活性的基礎，而流感病毒是利用宿主細胞的蛋白質及其他物質原料進行復制擴增，因此培養(yǎng)基也是流感疫苗生產的關鍵因素。病毒感染前一般需要用新鮮的培養(yǎng)基交換或稀釋細胞懸液，然而在實驗室研究或工業(yè)生產中，在病毒生產階段更換的病毒維持培養(yǎng)基大多與用于細胞生長階段的細胞生長培養(yǎng)基是同一種［7-8］。由于病毒生產的特性不同于細胞生長，所需的生物合成原料與途徑也不同于細胞，采用細胞生長培養(yǎng)基進行病毒生產引起的營養(yǎng)物質需求和濃度配比的不平衡最終必將影響病毒的擴增效率［9-10］。因此，針對特定的病毒生產階段篩選適于流感病毒生產的維持培養(yǎng)基十分重要。同時，了解維持培養(yǎng)基中病毒感染后的細胞代謝特性，有利于進一步設計和優(yōu)化基于細胞培養(yǎng)的流感病毒生產工藝。

本研究基于MDCK細胞懸浮培養(yǎng)擴增流感病毒的生產工藝，執(zhí)行實驗次數為33次的Simplex Lattice實驗，并運用統(tǒng)計學方法確定維持培養(yǎng)基的基礎配方，使最高病毒產量高達214.062HAU/100 μL，且目前文獻報道的H9N2流感病毒生產工藝均未能達到此病毒滴度，說明該維持培養(yǎng)基具有支持MDCK細胞高效生產流感病毒的能力。此外，為研究高產過程的代謝特性，在2 L生物反應器中進行該維持培養(yǎng)基的產毒驗證的同時，以細胞生長培養(yǎng)基為對照，比較在兩種培養(yǎng)基中病毒感染后的細胞代謝動力學，為其他細胞系的病毒疫苗用培養(yǎng)基開發(fā)提供指導和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與病毒株 本實驗所用貼壁MDCK細胞購自ATCC；MDCK懸浮細胞為實驗室前期從貼壁MDCK細胞馴化所得；甲型流感病毒株A/chicken/Guangdong/SS/94（H9N2）為肇慶大華農生物藥品有限公司惠贈，并在MDCK懸浮細胞中適應傳代，其TCID50值 108virions/mL。

1.1.2 培養(yǎng)基 XenoTM-S001S MDCK培養(yǎng)基，由上海倍諳基生物科技有限公司提供，在下文重命名為XP培養(yǎng)基；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；6種基礎無血清培養(yǎng)基為實驗室無血清配方庫中挑選所得，分別命名為A、B、C、D、E和F培養(yǎng)基。其中A、B、C、E和 F培養(yǎng)基為實驗室自主研發(fā)的5種無血清培養(yǎng)基，專利號分別為CN 103045533 A、CN 1778902 A、CN 104328158 A、CN 101603026 A和CN 101760442 A，而D培養(yǎng)基是在國外培養(yǎng)基的基礎上研制而成，專利號為US 8，846，032 B2。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 種子細胞培養(yǎng)：MDCK懸浮細胞以1×106cells/mL的細胞密度稀釋接種于125 mL搖瓶（Corning，USA）中，工作體積為30 mL，2 d傳 1代，維持細胞活性在95%以上，所用傳代培養(yǎng)基為XP培養(yǎng)基。搖瓶置于130 r/min的搖床上，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。生物反應器培養(yǎng)：取對數生長期的種子細胞，以1.0×106cells/mL的細胞密度接種至2 L生物反應器中，工作體積為1 L，細胞生長培養(yǎng)基為XP培養(yǎng)基。細胞生長階段反應器參數設置為：pH為7.0±0.2，溫度為37℃，DO為40%空氣飽和度，攪拌轉速為130 r/min。

1.2.2 病毒感染 搖瓶中的病毒感染：當MDCK懸浮細胞生長到10-12×106cells/mL時，在125 mL搖瓶中采用1∶1稀釋的方法（15 mL細胞液+15 mL培養(yǎng)基）進行病毒感染實驗，TPCK-胰酶（Sigma，USA）添加濃度為5 μg/mL，病毒種子液按MOI為0.001添加，并且置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

生物反應器中的病毒感染：當細胞密度達到10-12×106cells/mL時，棄掉一半的細胞液并補加同等體積的維持培養(yǎng)基（1∶1稀釋）至反應器中進行病毒感染，病毒種子液按MOI=0.001接入，TPCK-胰酶按5 μg/mL添加，且置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。病毒感染階段反應器參數設置中僅pH值不同于細胞生長階段，pH為7.2±0.2。

1.2.3 Simplex Lattice實驗設計 運用Design Expert（Version 8.0.6）軟件，以A-F等6種基礎培養(yǎng)基為變量，進行Simplex Lattice實驗設計，設計矩陣如表1所示。按表1將A-F等6種基礎培養(yǎng)基按比例混合，共設計34組實驗；其中第34組為XP培養(yǎng)基，作為對照組。將處于指數生長期的種子細胞以1.0×106cells/mL的細胞密度接種至1 L的搖瓶中，工作體積為300 mL，在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當細胞密度達到10-12×106cells/mL時，按1.2.2中的方法在125 mL搖瓶中進行病毒感染實驗。

1.2.4 細胞取樣及樣品分析 培養(yǎng)過程中，每隔24h進行取樣計數，細胞懸液經1 500 rpm離心5 min后上清液于-80℃儲存，用于進一步的病毒滴度或代謝物濃度檢測。

1.2.5 細胞計數 通過臺盼藍染色法采用IC1000自動細胞計數儀（Countstar，China）測量培養(yǎng)過程中的細胞密度和活性。

表1 Simplex Lattice實驗設計矩陣及響應值結果

1.2.6 流感病毒滴度檢測 總流感病毒滴度由Kalbfuss［11］所描述的病毒HA滴度檢測方法所確定，HA滴度的單位為HAU/100μL。單細胞產毒率（CSVY）的計算方法見文獻［12］，單位為virions/cell。

1.2.7 代謝物濃度檢測 葡萄糖、乳酸和氨的濃度 由 BioProfile 100 Plus analyzer（Nova Biomedical，USA）檢測，氨基酸濃度由高效液相色譜HPLC（Agilent，USA）測定，操作按使用說明書進行。

1.2.8 代謝物比消耗或比生成速率及轉化率計算

代謝物消耗或生成速率計算：

式中，Qi為物質i在t1到t2時間段內的比消耗或比 生 成 速 率（mmol/（109cells·day））；ΔCi為 物質i在t1到t2時間段內的濃度差（mmol/L）；IVCD為t1到t2時間段內活細胞密度對時間的積分（109cells·day/L）。

代謝物得率計算：

式中，Ylac/gluc和Yamm/gln分別為乳酸對葡萄糖的轉化得率（mmol/mmol）和氨對谷氨酰胺的轉化得率（mmol/mmol），Qlac和Qamm分別為乳酸和氨的比生成速率（mmol/（109cells·day）），Qgluc和Qgln分別為葡萄糖和谷氨酰胺的比消耗速率（mmol/（109cells·day））。

1.2.9 統(tǒng)計學分析 實驗結果采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05表示實驗結果存在顯著性差異。

2 結果

2.1 高產流感病毒維持培養(yǎng)基的篩選

Simplex Lattice實驗中，以病毒感染過程中的最大HA滴度（MAX.HA）及最大單細胞產毒率（CSVY）為響應值，實驗結果如表1所示。運用Design-Expert軟件，對表1中實驗組響應值進行方差分析，如表2所示。MAX.HA的二次多項式模型P值為0.0004，故模型顯著，滿足如下方程：

表2 Simplex Lattice實驗的方差分析

由表2可知，CSVY的二次多項式模型P值為0.134 5，故模型不顯著。根據單純形算法，以MAX.HA最大且CSVY符合要求為優(yōu)化指標，通過軟件分析確定A-F等6個影響因素的最佳取值，可得：當A和F培養(yǎng)基以0.568∶0.432比例混合時得到無血清培養(yǎng)基為最適合流感病毒生產的維持培養(yǎng)基，命名為X-MM培養(yǎng)基。

2.2 生物反應器驗證

在2 L生物反應器中驗證X-MM培養(yǎng)基所支持流感病毒在MDCK細胞中的擴增能力，并以XP培養(yǎng)基作為對照組比較產毒差異，結果如圖1所示。由圖1-A可知，在X-MM培養(yǎng)基中24、48、72 hpi時流感病毒的HA滴度分別為212.697、214.016、214.062HAU/100 μL，較XP培養(yǎng)基組分別提高了71%、64%和58%左右。進一步計算CSVY，如圖1-B所示，X-MM培養(yǎng)基組的CSVY為3.62×104virions/cell，較對照組2.30×104virions/cell提高了57%左右。

2.3 維持培養(yǎng)基下的細胞代謝

為研究病毒感染后細胞在兩種培養(yǎng)基中產毒差異的原因，以XP培養(yǎng)基作為對照考察X-MM培養(yǎng)基中MDCK細胞感染流感病毒后的代謝特征，結果如圖2-4所示。圖2為MDCK細胞在兩種培養(yǎng)基下進行接毒實驗的葡萄糖（Gluc）、谷氨酰胺（Gln）、乳酸（Lac）及氨（Amm）的濃度變化。由圖可知，病毒感染時，兩培養(yǎng)基組中的初始代謝物濃度一致，但隨著病毒感染的復制，兩培養(yǎng)基組的代謝物濃度出現差異。由于病毒感染過程中的代謝物消耗或生成主要發(fā)生在0-24 hpi（早期），因此重點考察了Gluc、Lac、Amm及氨基酸（AA）在0-24 hpi比代謝速率情況（圖3）。由圖3-A可知，X-MM培養(yǎng)基組的QGluc和QLac分別為2.314和2.108 mmol/（109cells·day），均顯著高于XP培養(yǎng)基組，其QGluc和QLac分 別 為 1.695 和 1.234 mmol/（109cells·day）。進一步計算乳酸對葡萄糖的轉化率，可知X-MM培養(yǎng)基組和XP培養(yǎng)基組的Ylac/gluc分別為1.07和0.73，說明分別有約53.5%和36.5%的葡萄糖直接轉化為丙酮酸，再生成乳酸。通過分析胞內氨基酸的代謝情況（圖3-B），可知在病毒感染0-24 hpi兩培養(yǎng)基組中的生成類氨基酸有Glu、Asp、Ala和Gly，其中Gly僅在X-MM培養(yǎng)基組中生成，其他氨基酸均為消耗類氨基酸。進一步比較各類氨基酸的在兩種培養(yǎng)基組中的代謝差異，相較對照組，在X-MM培養(yǎng)基 組 中 Ser、Gln、Thr、Arg、Val、Met、Phe、Ile、Leu和Lys均是消耗增多的氨基酸，Asp和Ala是生成減少的氨基酸。而Ser、Arg和Ile的比消耗速率分別較對照組提高了58.59%、25.09%和16.26%，且均存在顯著性差異；Ala的比生成速率較對照組下降幅度最大，為69.43%。此外，由圖可知，病毒感染時0 hpi的培養(yǎng)液中的初始氨基酸濃度，較對照組，X-MM培養(yǎng)基組中的Glu、Gly和Ala濃度顯著下降，下降幅度分別為26.29%、14.29%和25.84%，而 Asn、Ser、Thr、Arg、Tyr、Cys、Met 和 Ile 濃度顯著增加，增加幅度分別為21.66%、13.71%、13.61%、21.51%、24.95%、11.54%、6.95%和8.17%，其他氨基酸濃度無顯著性差異。

圖1 兩種培養(yǎng)基下流感病毒滴度隨時間變化（A）和單細胞產毒率（B）

圖2 兩種培養(yǎng)基下流感病毒感染過程中MDCK細胞中葡萄糖和乳酸（A）、谷氨酰胺和氨（B）的濃度變化

3 討論

本研究采用Simplex Lattice實驗設計，通過統(tǒng)計學方法獲得適于流感病毒在MDCK細胞中高效擴增的維持培養(yǎng)基。在該培養(yǎng)基下，流感病毒在MDCK細胞中的最大HA滴度、單細胞產毒率及TCID50分別 可 達 214.062HAU/100 μL，3.62×104virions/cell 和107.585TCID50/mL，且均明顯高于細胞生長培養(yǎng)基組。因此，在病毒感染時以維持培養(yǎng)基替代細胞生長培養(yǎng)基，在病毒疫苗生產工藝中十分重要。此外，Wang等［13］在懸浮MDCK細胞體系中所生產的H9N2流感病毒滴度為210；李春艷等［14］報道H9N2流感病毒在基于MDCK細胞大規(guī)模微載體培養(yǎng)體系中的HA滴度為29，而本研究通過維持培養(yǎng)基優(yōu)化后的H9N2流感病毒滴度可達文獻報道最高滴度的16倍。在獲得高產維持培養(yǎng)基的基礎上，本研究首次揭示了MDCK細胞在高產條件下細胞的代謝特性。在X-MM組和XP組中，病毒感染后0 hpi的Gluc、Gln、Lac和Amm的初始濃度一致，但前者細胞在0-24 hpi對Gluc的消耗速率顯著高于后者，表明X-MM培養(yǎng)基組中營養(yǎng)物組分的差異很可能促使細胞的代謝通路發(fā)生了改變，因此細胞能夠快速攝取培養(yǎng)基中的葡萄糖以提供病毒高效生產過程中的物質能量需求。同時，在0-24 hpi時，X-MM培養(yǎng)基組下Ylac/gluc顯著高于在XP培養(yǎng)基組，表明前者進入糖酵解途徑的葡萄糖增多。Fontaine等［15］已報道糖酵解途徑是病毒自我復制所必需的代謝途徑，抑制糖酵解途徑會抑制胞外感染性病毒的生成及病毒基因合成。此外，病毒擴增會誘發(fā)宿主細胞凋亡，導致細胞線粒體膜受損及ATP合成量不足，而糖酵解途徑的增強可以改善因凋亡引起的能量ATP供給不足的問題［16］。因此，X-MM培養(yǎng)基組病毒產量更高的原因可能與細胞對葡萄糖利用率提高和糖酵解途徑的增強有關。

圖3 兩種培養(yǎng)基下流感病毒感染過程中MDCK細胞在0-24 hpi的比代謝速率

圖4 兩種培養(yǎng)基下流感病毒感染0 hpi時培養(yǎng)液中氨基酸的初始濃度

另外，分析高產維持培養(yǎng)基中的氨基酸代謝可以發(fā)現，在病毒感染早期，與對照組相比，X-MM培 養(yǎng) 基 組 中 Ser、Gln、Thr、Arg、Val、Met、Phe、Ile、Leu和Lys的比消耗速率均得到提高，同時有文獻報道細胞在產毒期會更多地消耗上述氨基酸用于病毒擴增［17-18］，這可能是X-MM培養(yǎng)基組病毒產量和感染性更高的原因之一。其中，Ser、Ile和Arg的消耗速率存在顯著性提高，且在采用X-MM培養(yǎng)基進行稀釋后，較高的Ser、Arg和Ile初始濃度暗示在病毒生產用維持培養(yǎng)基中此3種氨基酸的供給至關重要。在病毒生產過程中，Ser參與病毒基因表達中必不可少的磷脂酰絲氨酸的合成［19］，且有報道稱Ser在HIV病毒感染早期會促進病毒復制［20］，而另外兩種氨基酸的作用還有待深入研究。此外，X-MM培養(yǎng)基組中的Ala比生成速率較XP培養(yǎng)基組有大幅度下降。據報道，Ala會損害細胞生長和生產力［21-22］。而采用X-MM稀釋后0 hpi時的培養(yǎng)基的Ala濃度明顯低于采用XP培養(yǎng)基進行稀釋后的初始培養(yǎng)基中的濃度，說明在維持培養(yǎng)基中，合理的Ala濃度也是促進病毒產量提高的重要因素。因此，加強病毒感染過程中細胞內的糖酵解途徑及提高培養(yǎng)基中的絲氨酸、精氨酸和異亮氨酸的濃度、降低丙氨酸濃度，可以有效促進流感病毒在細胞內的擴增。同時，關注病毒感染早期的糖酵解途徑及上述關鍵氨基酸代謝將有利于實現更合理的病毒產量優(yōu)化過程。

4 結論

本研究通過Simplex Lattice實驗設計高效、快速地獲得一款適于流感病毒在MDCK細胞中高效擴增的維持培養(yǎng)基，其病毒滴度可達214.062HAU/100 μL，是現有文獻報道的16倍。在該高產維持培養(yǎng)基下探索細胞代謝差異發(fā)現，糖酵解途徑的增強，絲氨酸、精氨酸及異亮氨酸等氨基酸消耗速率的增強和丙氨酸生成速率的下降很可能是該培養(yǎng)基支持細胞高產的關鍵代謝特征。