兩種商品化培養(yǎng)液對(duì)胚胎體外發(fā)育和臨床結(jié)局的影響比較

潘承雙 徐芝慧 張歡 李燕 金建遠(yuǎn) 費(fèi)前進(jìn) 倪吳花

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，商品化培養(yǎng)液逐漸替代了實(shí)驗(yàn)室自制的培養(yǎng)液。相比實(shí)驗(yàn)室自制培養(yǎng)液，商品化培養(yǎng)液批次之間更穩(wěn)定、使用更方便，也更有利于實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制[1]?，F(xiàn)如今很多商品化培養(yǎng)液開(kāi)始用于拾卵、精子洗滌、體外受精、胚胎發(fā)育、胚胎冷凍等各個(gè)環(huán)節(jié)[2]。但是不同廠家的培養(yǎng)液成分各不相同[3]，因此有可能造成胚胎發(fā)育的差異。目前尚無(wú)定論哪種商品化培養(yǎng)液最適合胚胎的培養(yǎng)[4]。本研究對(duì)比分析了Cook培養(yǎng)液和Vitrolife培養(yǎng)液對(duì)胚胎體外發(fā)育和臨床結(jié)局的影響，探討這兩種培養(yǎng)液究竟哪種更適合胚胎體外發(fā)育。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2014年3至8月在本中心行常規(guī)體外受精-胚胎移植（IVF-ET）893例和卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植（ICSI-ET）320例新鮮周期的臨床數(shù)據(jù)。入組標(biāo)準(zhǔn)：因女方輸卵管因素、男方少弱畸精子癥、梗阻型無(wú)精子癥及其他因素在本中心接受IVF/ICSI-ET助孕治療的患者。所有入選周期排除了女性子宮因素（如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥等）及其他疾病因素（如卵巢儲(chǔ)備功能下降、染色體臂間倒位、多囊卵巢綜合征等）。根據(jù)使用的培養(yǎng)液不同，IVF-ET周期分為Cook組456例和Vitrolife組437例，ICSI-ET周期分為Cook組143例和Vitrolife組177例。

1.2 方法

1.2.1 超排卵方案 采用黃體期長(zhǎng)方案和短方案進(jìn)行[5] 。

1.2.1.1 黃體期長(zhǎng)方案 即促性腺激素（Gn）治療周期的前一個(gè)月經(jīng)周期的黃體中期肌肉注射0.5～0.9mg促性腺激素釋放激素（GnRH）激動(dòng)劑（醋酸曲普瑞林針，3.75mg/支，法國(guó)益普生制藥公司），14d后達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)，即子宮內(nèi)膜≤5mm或血清雌二醇（E2）≤50pg/L，血清黃體生成激素（LH）水平≤5mIU/ml，開(kāi)始使用促性腺激素針（基因重組卵泡刺激素，75IU/支，瑞士雪蘭諾公司）。

1.2.1.2 短方案 于月經(jīng)周期第2天開(kāi)始，皮下注射短效GnRH激動(dòng)劑0.1mg/d（醋酸曲普瑞林針，0.1mg/支，瑞士輝瑞制藥有限公司），從月經(jīng)第3天開(kāi)始使用促性腺激素Gn針（基因重組卵泡刺激素，75IU/支，瑞士雪蘭諾公司）。

上述兩種方案，用Gn 150U/d或225U/d連續(xù)5d后，根據(jù)卵泡生長(zhǎng)和血清E2水平調(diào)整用量，當(dāng)B超監(jiān)測(cè)到至少3個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥17mm時(shí)，當(dāng)晚肌肉注射重組人絨毛膜促性腺素 250μg（250μg/支，瑞士雪蘭諾公司），34～36h后取卵。

1.2.2 精液處理 精液液化后，行IVF的精液經(jīng)非連續(xù)密度梯度離心法處理后，在G-IVF Plus（Vitrolife組）或K-SIFM（Cook組）受精液中上游1h后備用；行ICSI的精液經(jīng) G-MOPS Plus（Vitrolife組）或 K-SIGB（Cook組）直接離心后備用。受精前按照WHO標(biāo)準(zhǔn)[6]，分別檢測(cè)精液的量、濃度和活動(dòng)率。

1.2.3 IVF/ICSI 取卵后，根據(jù)臨床指征行IVF或ICSI。IVF受精：分別將卵子和精子加入到G-IVF Plus（Vitrolife組）或K-SIFM（Cook組）培養(yǎng)液滴中進(jìn)行受精。ICSI受精：卵子經(jīng)過(guò)透明質(zhì)酸酶（100IU/ml，美國(guó)Sigma公司）剝除顆粒細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移至G-MOPS Plus（Vitrolife組）或K-SIGB（Cook組）培養(yǎng)液滴中行ICSI。受精后16～18h，胚胎轉(zhuǎn)移至 G1 Plus（Vitrolife組）或 K-SICM（Cook組）培養(yǎng)液中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察受精情況，見(jiàn)到雙原核和雙極體為正常受精。

1.2.4 胚胎質(zhì)量評(píng)估 成功受精胚胎體外培養(yǎng)至第3天，根據(jù)本中心臨床操作實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)分。優(yōu)質(zhì)胚胎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[7]為：正常受精發(fā)育而來(lái)的胚胎，卵裂球數(shù)目7～9個(gè)，碎片≤15%，卵裂球無(wú)明顯大小差異，定義為Ⅰ級(jí)胚胎；可移植胚胎的標(biāo)準(zhǔn)為：卵母細(xì)胞正常受精后第3天形成4細(xì)胞Ⅱ級(jí)以上的胚胎。其余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚期，行冷凍保存。

1.2.5 胚胎移植和妊娠檢查 選擇評(píng)分最高的2～3枚胚胎進(jìn)行移植，剩余胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，以移植后4周陰道B超下出現(xiàn)孕囊和胎心為臨床妊娠[8]。

1.2.6 觀察指標(biāo) 患者一般情況（年齡、不孕年限、BMI、原發(fā)不孕率），獲卵個(gè)數(shù)，正常受精率，卵裂率，第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率，ET個(gè)數(shù)，種植率，妊娠率等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 IVF-ET周期中Cook組和Vitrolife組年齡、不孕年限、BMI和原發(fā)不孕率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。ICSI-ET周期中Cook組和Vitrolife組年齡、不孕年限、BMI和原發(fā)不孕率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表2。

表1 IVF-ET周期中Cook組和Vitrolife組一般資料比較

表2 ICSI-ET周期中Cook組和Vitrolife組一般資料比較

2.2 IVF-ET周期中Cook與Vitrolife培養(yǎng)液對(duì)胚胎體外發(fā)育和臨床結(jié)局的影響 IVF-ET周期中Cook組和Vitrolife組獲卵個(gè)數(shù)、正常受精率、卵裂率、ET個(gè)數(shù)、種植率、妊娠率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但Vitrolife組第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率明顯高于Cook組，差 異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 IVF-ET周期中Cook與Vitrolife培養(yǎng)液對(duì)胚胎體外發(fā)育和臨床結(jié)局的影響

2.3 ICSI-ET周期中Cook與Vitrolife培養(yǎng)液對(duì)胚胎體外發(fā)育和臨床結(jié)局的影響 ICSI-ET周期中Cook組和Vitrolife組獲卵個(gè)數(shù)、正常受精率、卵裂率、ET個(gè)數(shù)、種植率、妊娠率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但Vitrolife組第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率明顯高于Cook組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表4。

表4 ICSI-ET周期中Cook與Vitrolife培養(yǎng)液對(duì)胚胎體外發(fā)育和臨床結(jié)局的影響

3 討論

本研究比較了Cook培養(yǎng)液和Vitrolife培養(yǎng)液對(duì)胚胎體外發(fā)育和臨床結(jié)局的影響，結(jié)果證實(shí)無(wú)論是IVFET周期還是ICSI-ET周期，Cook組和Vitrolife組獲卵個(gè)數(shù)、正常受精率、卵裂率、ET個(gè)數(shù)、種植率、妊娠率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Vitrolife組第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率均明顯高于Cook組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對(duì)于哪種商品化培養(yǎng)液更加有利于胚胎體外發(fā)育，學(xué)術(shù)界至今仍有爭(zhēng)議。近年來(lái)，一些研究開(kāi)始探討不同培養(yǎng)液對(duì)體外受精臨床結(jié)果的影響。Mauri等[9]比較了P1培養(yǎng)液和IVF-50培養(yǎng)液對(duì)ICSI周期胚胎發(fā)育以及臨床結(jié)局的影響，發(fā)現(xiàn)兩者之間受精率、卵裂率、種植率、臨床妊娠率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ben-Yosef等[10]比較了Cook培養(yǎng)液和P1培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)兩者之間受精率、形態(tài)學(xué)評(píng)分比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但P1組臨床妊娠率和種植率要優(yōu)于Cook組。而Zollner等[11]分析比較了Vitrolife培養(yǎng)液和MediCult培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)兩者之間受精率、卵裂率、種植率、臨床妊娠率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與本研究結(jié)果類似。蔣益群等[12]分析比較了Vitrolife培養(yǎng)液和Cook培養(yǎng)液，認(rèn)為兩者對(duì)妊娠結(jié)局并無(wú)明顯影響，但Cook培養(yǎng)液可能更有利于囊胚階段的發(fā)育。Wunder等[13]研究比較了Vitrolife培養(yǎng)液和 Cook培養(yǎng)液，認(rèn)為兩種培養(yǎng)液在初生兒體重影響上無(wú)差異。

目前，筆者尚不清楚為何Vitrolife組第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率要明顯高于Cook組。筆者推測(cè)這可能是由于兩組培養(yǎng)液組成成分不一樣，因而造成胚胎發(fā)育差異。Cook培養(yǎng)液與Vitrolife培養(yǎng)液大部分成分比較相似，但部分成分存在差異，其中兩者之間乳酸濃度以及乳酸∶丙酮酸比值存在很大差別。Vitrolife培養(yǎng)液中乳酸鹽濃度為10.8mM，高于Cook培養(yǎng)液的1.8mM；Vitrolife培養(yǎng)液中乳酸∶丙酮酸比值為36，高于Cook培養(yǎng)液的5[3]。乳酸和丙酮酸均可作為早期胚胎發(fā)育的能源物質(zhì)，不同的是丙酮酸可以直接進(jìn)入檸檬酸循環(huán)，而乳酸必須先通過(guò)乳酸脫氫酶作用轉(zhuǎn)化為丙酮酸方可進(jìn)入檸檬酸循環(huán)[14]。乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的過(guò)程中會(huì)涉及氧化態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的消耗以及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的產(chǎn)生。而NAD+和NADH在維持細(xì)胞內(nèi)代謝和氧化還原狀態(tài)方面起著重要作用[15-16]，因此不僅僅是乳酸和丙酮酸的濃度影響胚胎的發(fā)育，乳酸∶丙酮酸比值同樣影響胚胎的潛能。鼠胚研究證實(shí)細(xì)胞內(nèi)的高乳酸∶丙酮酸比值會(huì)降低丙酮酸在細(xì)胞內(nèi)的氧化作用[17]，進(jìn)而造成細(xì)胞內(nèi)氧濃度不同。而氧濃度不同則會(huì)造成丙酮酸吸收的差異[18]，最終又會(huì)影響胚胎體外發(fā)育。此外，Cook培養(yǎng)液與Vitrolife培養(yǎng)液中存在其他成分的差異：Vitrolife培養(yǎng)液中添加了0.08mm的檸檬酸鹽，對(duì)應(yīng)Cook培養(yǎng)液則為0；Cook培養(yǎng)液中添加了81μm的天冬氨酸鹽，對(duì)應(yīng)Vitrolife培養(yǎng)液為0[3]。培養(yǎng)液中這些成分的差異，很可能通過(guò)影響胚胎在培養(yǎng)液中代謝，最終導(dǎo)致胚胎發(fā)育的差異。

雖然Vitrolife組第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率明顯高于Cook組，但兩種培養(yǎng)液對(duì)種植率和妊娠率均沒(méi)有影響。筆者認(rèn)為可能由以下原因造成：首先，ET時(shí)只挑選2～3枚胚胎移植，雖然Cook組第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率低于Vitrolife組，但仍舊可以提供足夠優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植；其次，有文獻(xiàn)報(bào)道第3天形態(tài)學(xué)評(píng)分并不能完全反映胚胎的種植潛能[19]。

本研究顯示Vitrolife組第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率明顯高于Cook組，但兩種培養(yǎng)液對(duì)種植率和妊娠率均沒(méi)有影響。因此，暫時(shí)很難下結(jié)論Vitrolife培養(yǎng)液是否優(yōu)于Cook培養(yǎng)液。下一步研究筆者考慮擴(kuò)大樣本量以及延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)至第6天，比較兩組囊胚形成率是否存在差異，同時(shí)進(jìn)行隨訪分析比較兩組出生胎兒的體重、性別比例等指標(biāo)是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這將有助于進(jìn)一步了解和比較Cook培養(yǎng)液和Vitrolife培養(yǎng)液對(duì)胚胎體外培養(yǎng)的影響。