劉宇彤　霍璐陽　李志國　劉晴　董愛榮

摘要：本文分別采用靛酚藍比色法、3.5-二硝基水楊酸法、高錳酸鉀滴定的方法，探究在土壤中種植大豆、加入粘質沙雷氏菌和咪唑乙煙酸及三者相互作用對土壤脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶活性的影響。結果表明：在土壤中種植大豆后，土壤脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性在培養(yǎng)10～30 d中均呈現(xiàn)激活趨勢;在土壤中加入粘質沙雷氏菌，5～20 d中，土壤脲酶、蔗糖酶活性均呈現(xiàn)激活趨勢，粘質沙雷氏菌使土壤過氧化氫酶活性顯著增加;在土壤中加入100 mg/kg濃度的咪唑乙煙酸，土壤脲酶呈現(xiàn)恢復—抑制的趨勢，土壤蔗糖酶活性在10 d時開始激活，30 d時呈現(xiàn)抑制狀態(tài)，過氧化氫酶活性在10 d和30 d時均有激活趨勢;在土壤中種植大豆、加入粘質沙雷氏菌，再加入100 mg/kg的咪唑乙煙酸，土壤脲酶呈現(xiàn)抑制—恢復—抑制的趨勢，土壤蔗糖酶活性呈現(xiàn)激活—恢復—抑制—激活的趨勢，土壤過氧化氫酶活性呈現(xiàn)抑制—激活—抑制的趨勢。綜上所述，說明不同處理方式對土壤脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性產生的變化顯著。

關鍵詞：大豆; 粘質沙雷氏菌; 咪唑乙煙酸; 脲酶; 蔗糖酶; 過氧化氫酶

中圖分類號：S158.4文獻標識碼：A文章編號：1006-8023（2019）02-0021-06

Effects of Different Treatments on Soil Enzyme Activity

LIU Yutong， HUO Luyang， LI Zhiguo， LIU Qing， DONG Airong

（College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040）

Abstract：In order to explore the effects of adding soybean， serratia marcescens and imidazolidinic acid on the soil urease， sucrase and catalase activities， the indophenol blue colorimetric method and 3.5-dinitrogen were used respectively. The results showed that the soil urease， sucrase and catalase activities showed activating trend in the culture for 10 ～ 30 d after planting soybean in the soil. Serratia marcescens was added to the soil， after 5 ～ 20 d， soil urease and sucrase activities showed activating trend， which meant that serratia marcescens significantly increased soil catalase activity. Adding 100 mg/kg imidazolidinic acid to soil， soil urease showed recovery-suppression trend， soil sucrose enzyme activity began to activate at 10 d， and inhibited at 30 d. Catalase activity was activated at 10 d and 30 d. Soy was planted in soil， added with serratia marcescens and 100 mg/kg imidazolium acid， soil urease showed a trend of inhibition-recovery-inhibition， the soil invertase activity showed a trend of activation-recovery-inhibition-activation， and soil catalase activity showed a trend of inhibition-activation-suppression. In summary， the changes in soil urease， sucrase and catalase activities were significantly different for different treatments.

Keywords：Serratia marcescens; imidazolium; urease; sucrase; catalase

0引言

化學農藥多是有害物質，長期持續(xù)使用化學農藥，會對生物和環(huán)境造成危害，而且由于耐藥性的產生，防治效果逐漸減弱，農藥的殘留也給生態(tài)環(huán)境帶來了許多負面影響。咪唑乙煙酸是咪唑啉酮類除草劑，由于其持效期長，所以在土壤中的殘留會對下茬敏感作物產生藥害，嚴重影響種植業(yè)結構的調整。

土壤酶是土壤中植物、動物和微生物活動的產物，是數(shù)量極微而作用極大的土壤組成部分，在物質轉化、能量代謝和污染土壤修復等過程中發(fā)揮著重要作用?[1]。土壤酶在土壤中無處不在，以穩(wěn)定蛋白質的形態(tài)存在于土壤中，具有生物催化能力?[2-3]。土壤微生物所引起的各種生物化學過程，全部是借助于它們所產生的酶來實現(xiàn)的。因此，土壤酶的活性，可作為判斷土壤生物化學過程強度及評價土壤肥力指標之一?[4]。不僅能反應土壤的理化性質，還是土壤生物活性的重要體現(xiàn)。土壤脲酶的作用很專一，土壤中尿素被其水解，生成氨、二氧化碳和水。土壤蔗糖酶可水解蔗糖，反映土壤有機碳轉化能力?[5]，與土壤中有機質、氮、磷含量，微生物數(shù)量及土壤呼吸強度有關，土壤蔗糖酶的作用直接關系到作物的生長?[6]。土壤過氧化氫酶是生物呼吸、生物代謝過程，以及土壤動物、植物根系分泌及殘體分解中的重要酶類，過氧化氫酶主要分解土壤中的過氧化氫，降低土壤中過度累積的過氧化氫對植物根系的危害?[7]，與土壤性質關系密切，是較好的土壤微生態(tài)環(huán)境指示因子?[8]，其活性可表示土壤氧化過程的強度，并能有效防止土壤及生物體在新陳代謝過程中產生的過氧化氫所造成的毒害?[9]。

土壤酶學特征已作為一種潛在的指標體系指示有關土壤質量?[10]。近年來，隨著土壤酶活性研究方法及技術的不斷更新，加之與其它學科的交叉與整合，不少學者發(fā)現(xiàn)，土壤酶具有評價土壤肥力?[11]、診斷土壤污染?[12]、評價土壤質量?[13]、培肥土壤?[14]及防治植物病蟲害?[15]等方面的功能。本文分別以土壤脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶為指標，設計盆栽試驗，通過土壤中分別添加粘質沙雷氏菌（高效降解菌）、不同濃度的咪唑乙煙酸、種植大豆和三者互相作用，明確單因子及三者互相作用對土壤酶活性的影響，進一步揭示在種植大豆的土壤中加入粘質沙雷氏菌對咪唑乙煙酸的降解作用及對土壤酶活性的影響，旨在為粘質沙雷氏菌修復農藥污染土壤的研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

盆栽試驗土壤為?m?草炭∶?m?沙子∶?m?土 = 5∶3∶2的比例進行混合所得。大豆品種是黑農48。菌種是試驗前期馴化得到的高效降解菌株粘質沙雷氏菌（?Serratia marcescens?）。

培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g， 蒸餾水1 000 mL，pH = 7.5～7.6。

1.2盆栽試驗

以不種植大豆、不加粘質沙雷氏菌及咪唑乙煙酸的盆栽試驗組為對照組CK;試驗組A1，選擇籽粒飽滿、均勻、無病蟲的大豆種子，每盆擺15播粒，覆土2 cm，放在盆栽內自然生長;試驗組A2，將粘質沙雷氏菌接種于牛肉膏蛋白胨平板中，放入培養(yǎng)箱，30 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)48 h，挑取菌株轉入富集培養(yǎng)基中，160 r/min，30 ℃，搖培48 h，將菌液均勻地混入試驗用土壤中;試驗組A3，在試驗用土壤中加入5%咪唑乙煙酸水劑，制成咪唑乙煙酸質量分數(shù)為100 mg/kg的污染土。試驗組A4，按照上述試驗組中大豆、粘質沙雷氏菌和咪唑乙煙酸的規(guī)格，將大豆種植于試驗用土中，再將粘質沙雷氏菌和咪唑乙煙酸混入試驗用土中。五組試驗組在處理后5、10、20、30、40 d分別用五點法取土樣，風干，過10目篩，放入冰箱4 ℃保存待用，具體情況見表1。

1.3酶活性的測定

土壤脲酶的測定采用靛酚比色法?[16]。脲酶活性以24 h后1 g土壤中含NH3-N的毫克數(shù)表示：

y?1 = 0.038 4?x?1 + 0.003 9。

R?1?2 = 0.997 9。

式中：?y?1為吸光值;?x?1為氮工作液濃度;?R?1?2為相關系數(shù)。蔗糖酶活性測定采用3.5-二硝基水楊酸法?[17]。脲酶活性以24 h后1 g土壤中含葡萄糖的毫克數(shù)表示：

y?2 = 0.073 5?x?2 + 0.008 6。

R?2?2 = 0.999 2。

式中：?y?2為吸光值;?x?2為葡萄糖含量，mg;?R22為相關系數(shù)。

過氧化氫酶活性檢測采用高錳酸鉀滴定法?[18]：

E=（v-vs） c×（51/v0）×（17/w）。

式中：?E過氧化氫酶活性;v為v0體積空白溶液所消耗的高錳酸鉀體積;vs 為v0體積樣品溶液所消耗的高錳酸鉀體積;c為高錳酸鉀的濃度;w為土壤重量。

土壤酶活性的抑制率（激活率）計算公式為：

抑制率或激活率（%）= [（?B-A）/A?]×100。

式中：?A為空白對照的土壤酶活性;B?為不同處理所得的土壤酶活性。結果為正值時表示激活率，為負值時表示抑制率。

1.4數(shù)據(jù)分析

用Excel2010對數(shù)據(jù)進行計算和繪圖;運用SPSS16.0軟件進行差異性分析，并采用鄧肯方法進行顯著性差異分析（?P< 0.05）;圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

2結果與分析

2.1大豆、粘質沙雷氏菌和咪唑乙煙酸及三者相互作用對土壤脲酶活性的影響

由圖1可知，在土壤中種植大豆后，土壤脲酶活性基本呈現(xiàn)出激活的趨勢，土壤脲酶活性5 d時略低于水平對照，抑制率僅為1.27%;10 d時開始上升，脲酶活性最高達9.03 mg/g，激活率最高達13.11%;30 d后，激活率逐漸下降，但土壤脲酶活性仍高于水平對照。在土壤中加入粘質沙雷氏菌后，土壤脲酶活性呈現(xiàn)出激活—恢復—激活的趨勢，土壤脲酶活性5 d時開始上升，脲酶活性最高達10.71 mg/g，激活率最高達20.87%;20 d時，激活率逐漸下降，但土壤脲酶活性仍高于水平對照;30d時恢復對照水平;40 d又有激活趨勢，但激活率不高，僅1.29%。在土壤中加入100 mg/kg的咪唑乙煙酸后，土壤脲酶活性基本呈現(xiàn)激活—抑制的趨勢，土壤脲酶活性5 d時開始下降，10 d時開始抑制;30 d時抑制率最高達17.82%。在土壤中種植大豆、加入粘質沙雷氏菌，再加入100 mg/kg的咪唑乙煙酸后，土壤脲酶基本呈現(xiàn)抑制—恢復—抑制的趨勢，5 d時土壤脲酶活性被顯著抑制;10d時恢復到對照水平;20 d后脲酶活性一直被抑制，直到實驗結束，脲酶活性最低達7.94 mg/g，抑制率最高達到10.39%。

2.2大豆、粘質沙雷氏菌和咪唑乙煙酸及三者相互作用對土壤蔗糖酶活性的影響

由圖2可知，在土壤中種植大豆后，土壤蔗糖酶活性呈現(xiàn)出抑制—激活的趨勢，土壤蔗糖酶活性5 d時低于水平對照，抑制率為3.6%;10 d時，蔗糖酶活性達到最高為36.34 mg/kg，激活率最高達27.4%;20～40 d時，激活率逐漸下降，但土壤蔗糖酶活性仍高于水平對照。在土壤中加入粘質沙雷氏菌后，土壤蔗糖酶活性呈現(xiàn)出激活—抑制—激活的趨勢，且均與對照CK的蔗糖酶活性差異性顯著（?P?<0.05）。在培養(yǎng)期間，5 d時，土壤蔗糖酶活性顯著升高;10 d時土壤蔗糖酶活性最高達44.94 mg/kg，激活率達57.45%;20～30 d時逐漸恢復對照后，土壤蔗糖酶活性開始被抑制，蔗糖酶活性最低達29.18 mg/kg，抑制率最高達14.42%;40 d時，又出現(xiàn)激活趨勢，激活率達24.89%。在土壤中加入100 mg/kg的咪唑乙煙酸后，土壤蔗糖酶活性呈現(xiàn)激活—恢復—抑制的趨勢，10 d時開始激活，活性最高達38.41 mg/kg，激活率最高達34.69%;20 d時恢復水平對照;30 d開始抑制，抑制率最高達6.93%。在土壤中種植大豆、加入粘質沙雷氏菌，再加入100 mg/kg的咪唑乙煙酸后，土壤蔗糖酶活性呈現(xiàn)激活—抑制—激活的趨勢，土壤蔗糖酶活性10 d時蔗糖酶活性最高為55.84 mg/kg，激活率達95.78%;20 d時，依然處于激活狀態(tài);從30 d 開始，土壤蔗糖酶活性被顯著抑制，蔗糖酶活性最低達21.52 mg/kg，抑制率最高達20.73%。

2.3大豆、粘質沙雷氏菌和咪唑乙煙酸及三者相互作用對土壤過氧化氫酶活性的影響

由圖3可知，在土壤中種植大豆后，土壤過氧化氫酶活性呈現(xiàn)出激活—抑制的趨勢，土壤過氧化氫酶活性5 d時開始上升，直到30 d，一直高于水平對照，活性最高達2.57 mg/g，激活率最高達34.09%;30 d后，激活率逐漸下降，直至達到抑制狀態(tài);40 d時，抑制率達30%。在土壤中加入粘質沙雷氏菌后，過氧化氫酶活性一直呈現(xiàn)激活狀態(tài)，且均與對照組CK差異性顯著（P?< 0.05），土壤過氧化氫酶活性5d時開始上升;20 d時土壤過氧化氫酶活性最高為2.27 mg/g，激活率達36.00%;直到40 d時才逐漸恢復至水平對照。在土壤中加入100 mg/kg的咪唑乙煙酸后，土壤過氧化氫酶活性呈現(xiàn)出抑制—激活—抑制的趨勢，10～30 d一直處于激活狀態(tài)，活性最高達2.27 mg/g，激活率最高達43.59%;40 d時處于抑制狀態(tài)，抑制率達8%。在土壤中種植大豆、加入粘質沙雷氏菌，再加入100 mg/kg的咪唑乙煙酸后，土壤過氧化氫酶活性呈現(xiàn)抑制—激活—抑制的趨勢，在5 d時土壤過氧化氫酶活性最低為2.07 mg/g，抑制率最高達10.14%;10 d后土壤過氧化氫酶活性開始被激活，10 d時脲酶活性最高達2.07 mg/g，激活率最高達40.91%。40 d后土壤過氧化氫酶活性開始下降，酶活性最低達1.47 mg/g，抑制率激活最高達12.00%。

3討論

許多研究表明，土壤酶活性隨季節(jié)變化有明顯規(guī)律，不同性質的酶類有些許區(qū)別，但均是冬季活性最低，春季上升，夏秋季活性較高?[19]。本實驗研究是在夏季大棚內進行，檢測了不同試驗組土壤中相關酶活性的變化。結果表明在土壤中分別種植大豆、添加粘質沙雷氏菌和咪唑乙煙酸以及三者共同作用后的土壤脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性隨著種植時間的增長呈現(xiàn)出其獨有的規(guī)律性的變化。

本研究表明，在土壤中種植大豆后，土壤脲酶活性基本呈現(xiàn)激活的趨勢;土壤蔗糖酶活性呈現(xiàn)出抑制—激活的趨勢;土壤過氧化氫酶活性呈現(xiàn)出激活—抑制的趨勢。在土壤中加入粘質沙雷氏菌后，土壤脲酶活性呈現(xiàn)出激活—恢復—激活的趨勢;土壤蔗糖酶活性呈現(xiàn)出激活—抑制—激活的趨勢，且均與對照CK的蔗糖酶活性差異性顯著（?P?<0.05）;過氧化氫酶活性一直呈現(xiàn)激活狀態(tài)，且均與對照組CK差異性顯著（?P?<0.05）。在土壤中加入100 mg/kg的咪唑乙煙酸土壤脲酶活性基本呈現(xiàn)激活—抑制的趨勢，蔗糖酶活性呈現(xiàn)激活—恢復—抑制的趨勢;土壤過氧化氫酶活性呈現(xiàn)出抑制—激活—抑制的趨勢。在土壤中種植大豆、加入粘質沙雷氏菌，再加入100 mg/kg的咪唑乙煙酸，土壤脲酶基本呈現(xiàn)抑制—恢復—抑制的趨勢;土壤蔗糖酶活性呈現(xiàn)激活—抑制—激活的趨勢;土壤過氧化氫酶活性呈現(xiàn)抑制—激活—抑制的趨勢。

以粘質沙雷氏菌為降解菌，在培養(yǎng)期間各組與對照組均有顯著性差異。對照組土壤脲酶的活性比在土壤中加入咪唑乙煙酸的脲酶活性高，說明咪唑乙煙酸對脲酶在一定程度上有抑制作用。脲酶活性是表征土壤供氮能力的重要指標。在土壤中加入降解菌后，脲酶活性升高，土壤氮素水平升高，這可能是由于土壤中微生物死亡，細胞中的脲酶被釋放到土壤中，增強了土壤脲酶的活性?[20]。蔗糖作為降解菌的最適碳源之一，土壤蔗糖酶活性可以反映降解菌對碳源的吸收狀況，再結合過氧化氫酶活性的分析可知：以粘質沙雷氏菌為降解菌的試驗組A4中蔗糖酶和過氧化氫酶活性在10 d和20 d時呈激活狀態(tài)，酶活性達到峰值，此時粘質沙雷氏菌作為主要的碳源之一，在30 d時逐漸恢復平衡并開始降低，可能是粘質沙雷氏菌對碳源的需求開始降低，此時可能即將完成營養(yǎng)生長階段。以真菌為降解菌，土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性開始呈激活趨勢，當降解菌對碳源需求減弱時，激活趨勢逐漸減弱。

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