羅毅,汪敏加,蘇全生,何本翔,鄧友章,高偉強(qiáng),姜河

(1.成都體育學(xué)院附屬醫(yī)院博士后工作站, 四川成都610041;2.成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)與健康學(xué)院， 四川成都610041;3.成都中醫(yī)藥大學(xué)四川成都610075; 4.成都市第一人民醫(yī)院骨科, 四川成都610041)

椎間盤(pán)退變是臨床常見(jiàn)的疾病，可引起脊柱疼痛、腰疼、行走困難等多種臨床癥狀，給患者帶來(lái)巨大的痛苦，也給社會(huì)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。椎間盤(pán)退變的病理過(guò)程伴隨著椎間盤(pán)細(xì)胞、椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)的減少，而其細(xì)胞外基質(zhì)成分主要是蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白，與軟骨細(xì)胞相類似[2]，因此可通過(guò)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化成為軟骨細(xì)胞來(lái)修復(fù)椎間盤(pán)退變[3]。因此，促進(jìn)軟骨生成、修復(fù)具有重要的臨床意義。近年來(lái)，利用組織工程技術(shù)達(dá)到該目的逐漸成為研究的熱點(diǎn)，富血小板血漿 (Platelet-rich plasma，PRP)來(lái)源于自體，激活后可形成三維多孔結(jié)構(gòu)的凝膠，是組織工程技術(shù)中良好的支架材料[4]。PRP是血小板的濃縮物，富含有多種生長(zhǎng)因子，具有極高的生物安全性，可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及組織修復(fù)，并可促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化[5]；肌腱干細(xì)胞可從肌腱中分離進(jìn)行體外培養(yǎng)，具有自我更新能力及成骨、成軟骨、成脂肪分化潛能，可作為組織工程技術(shù)中的種子細(xì)胞[6]；TGF-β3是TGF-β超家族的成員，廣泛表達(dá)于各種組織中，介導(dǎo)多種干細(xì)胞的分化過(guò)程，其可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成肌腱分化[7]，還可促進(jìn)軟骨前體細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞[8]，但PRP凝膠及TGF-β3聯(lián)合使用對(duì)肌腱干細(xì)胞成軟骨分化的影響目前并不清楚，本文通過(guò)體外分離培養(yǎng)人跟腱來(lái)源肌腱干細(xì)胞，對(duì)PRP凝膠聯(lián)合TGF-β3對(duì)肌腱干細(xì)胞成軟骨分化的影響做初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與材料

L-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基：貨號(hào)為11885084、胎牛血清FBS：貨號(hào)為11011-8611、PBS緩沖液：貨號(hào)為P1022、中性蛋白酶dispase：貨號(hào)為D6430、Ⅰ型膠原酶：貨號(hào)為C8140、胰蛋白酶-EDTA消化液：貨號(hào)為T(mén)1300、100×青鏈霉素混合液：貨號(hào)為P1400、凝血酶：貨號(hào)為T(mén)8021、甲苯胺藍(lán)染色液：貨號(hào)為G2543，Solarbio公司；CD29-PE：貨號(hào)為HUTS-21，BD Biosciences公司；CD90-PE：貨號(hào)為130-097-932、CD34-FITC：貨號(hào)為130-081-001、CD106-FITC：貨號(hào)為130-104-124，上海振譽(yù)生物科技有限公司；BMP-2：貨號(hào)為PHC7141、地塞米松：貨號(hào)為D1383，Sigma公司；脯氨酸：貨號(hào)為BP1824-ONY，北京百奧萊博科技有限公司； ITS Premix混合液：貨號(hào)為092001344，西寶生物科技(上海)股份有限公司；維生素C：貨號(hào)為D1184，上海寶曼生物科技有限公司；Sox9、CollagenⅡ、GAPDH引物，上海生工生物工程股份有限公司合成；RNAiso Plus：貨號(hào)為9108、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：貨號(hào)為RR037Q/A/B、熒光定量PCR試劑盒：貨號(hào)為639519，Takara公司；GAPDH兔源一抗：貨號(hào)為ab181602、Sox9兔源一抗：貨號(hào)為ab185230、CollagenⅡ兔源一抗：貨號(hào)為ab34712、羊抗兔二抗：貨號(hào)為ab150077，Abcam公司；RIPA裂解液：貨號(hào)為P0013K、BCA試劑盒：貨號(hào)為P0011，碧云天生物技術(shù)研究所等

1.1.2 儀器

S-520掃描電鏡：日立公司；Model 680酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；CKX53倒置相差顯微鏡：日本Olympus 公司生產(chǎn)；1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀、CFX96 Touch Deep Well熒光定量PCR儀：美國(guó)Bio-Rad公司；3900型高通量DNA合成儀：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；RM2235石蠟切片機(jī)：德國(guó)Leica公司；Centrifuge 5424R低溫高速離心機(jī)：德國(guó) Eppendorf 股份公司等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及培養(yǎng)基的配制

hTSCs完全培養(yǎng)基：在L-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 %胎牛血清、100 U/mL的青霉素、鏈霉素混合液混勻。

hTSCs的體外分離、培養(yǎng)：參照文獻(xiàn)[9]，收集醫(yī)院骨科急性跟腱斷裂患者(經(jīng)知情同意)行跟腱縫合修補(bǔ)術(shù)時(shí)修剪的跟腱組織，在超凈工作臺(tái)中，以加入100 U/mL的青霉素、鏈霉素混合液的PBS漂洗干凈，，剪除表面部分結(jié)締組織，分離得到跟腱組織，將其剪為1 mm3的碎塊置于10 mL離心管中，加入10倍量濃度為1 %dispase酶、Ⅰ型膠原酶的混合液(比例為1∶1)，在37 ℃水浴中消化2 h，采用血清終止消化，以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，得到細(xì)胞沉淀，加入hTSCs完全培養(yǎng)基混勻，以孔隙為70 μm的細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾形成單細(xì)胞懸液，然后以以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，離心管底部的細(xì)胞沉淀以完全培養(yǎng)基重懸混勻，計(jì)數(shù)后以5×105個(gè)/mL的密度后接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5 % CO2 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次完全培養(yǎng)基(棄去未貼壁細(xì)胞)，培養(yǎng)約1周左右，胰酶消化后以完全培養(yǎng)基重懸混勻(記為原代細(xì)胞)，采用有限稀釋法接種于96孔培養(yǎng)板中，使每孔細(xì)胞為1～3個(gè)，在37 ℃、5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后標(biāo)記出單個(gè)細(xì)胞的孔，待單細(xì)胞克隆生長(zhǎng)至孔底80 %時(shí)，胰酶消化后合并多個(gè)單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，取第1～3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

hTSCs成軟骨分化培養(yǎng)基的配制[10]：在L-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 %胎牛血清、100 nmol/L地塞米松、100μg/mL丙酮酸鹽、40 μg/mL脯氨酸、50 mg/mL ITS Premix混合液(含6.25 mg/mL胰島素、6.25 mg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25 mg/mL亞硒酸、1.25 mg/m牛血清白蛋白、5.35 mg/mL亞油酸)、500 ng/mL BMP-2、50 mg/L維生素C混勻。

1.2.2 TSCs鑒定

CD29、CD90是hDPSCs的標(biāo)志抗原，CD34、CD106分別是造血干/祖細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的標(biāo)志抗原[11]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上述標(biāo)志抗原：將“1.2.1”中的第2代細(xì)胞胰酶消化后以完全培養(yǎng)基重懸混勻，計(jì)數(shù)后取含有5×105個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，細(xì)胞沉淀中加入300 μL含有1 μg CD29-PE、CD90-PE、CD34-FITC、CD106-FITC抗體的Buffer，4 ℃下避光孵育45 min，PBS 洗2次，12 000 g離心5 min，重懸于300 μL預(yù)冷的PBS中，以PE或FITC標(biāo)記的同型匹配的IgG作為陰性對(duì)照。采用流式細(xì)胞儀分選分析，以FlowJo軟件分析結(jié)果，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞百分率。

1.2.3 PRP凝膠的制備及其細(xì)胞相容性的檢測(cè)

“1.2.1”中的患者自體靜脈采血10 ml全血，參照文獻(xiàn)[12]，平分置入含1 ml復(fù)方枸櫞酸鈉的2個(gè)10 mL抗凝管中搖勻，以200 g的離心力離心10 min，吸取全部上清液至交界面下2 mm轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，待溶液平衡后再以以200 g的離心力離心10 min，吸去3/4的上清液棄去，剩余部分即為PRP。將PRP與激動(dòng)劑(由1 mL 10 %氯化鈣與1 000 U凝血酶混合而成)以9∶1的比例混合搖勻，靜置約2 min，形成PRP凝膠，經(jīng)固定、脫水、干燥、導(dǎo)電處理后行掃描電鏡檢測(cè)其立體結(jié)構(gòu)。

“1.2.1”中的第2代細(xì)胞胰酶消化后以完全培養(yǎng)基重懸混勻，計(jì)數(shù)后取細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，將其與自體PRP以1∶6的比例混合均勻后，按比例加入激活劑形成凝膠，加入完全培養(yǎng)基在37 ℃、5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換一次培養(yǎng)液，1周后經(jīng)上述方法處理后行掃描電鏡掃描檢測(cè)PRP凝膠-hTSCs復(fù)合物。按上述方法制備PRP凝膠-hTSCs復(fù)合物接種在于96孔培養(yǎng)板中，以未加PRP凝膠處理的細(xì)胞作為對(duì)照組(control)，每組設(shè)4個(gè)孔，分別在0 d、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d后加入CKK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，以全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下各孔吸光度(optical density，OD)，計(jì)算各組細(xì)胞在相應(yīng)時(shí)間的相對(duì)增殖率，以0 d時(shí)對(duì)照組相對(duì)增值率為100 %。公式為：相對(duì)增殖率(%)=藥物處理組OD值/0d時(shí)對(duì)照組OD值×100 %。

1.2.4 細(xì)胞處理及分組

以L-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基將TGF-β3配制為1 μg/mL的儲(chǔ)備液備用?！?.2.1”中的第2代細(xì)胞胰酶消化后以完全培養(yǎng)基重懸混勻，計(jì)數(shù)后取細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液接種在2個(gè)24孔培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為對(duì)照組(control)、TGF-β3組、PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組四組，以1.2.3中的方法制備PRP凝膠-hTSCs復(fù)合物后，根據(jù)分組加入TGF-β3處理細(xì)胞(使終濃度為10 ng/mL)[13]，并同時(shí)更換所有細(xì)胞培養(yǎng)基為成軟骨分化培養(yǎng)基，21 d后，一板細(xì)胞control組、TGF-β3組以4 %多聚甲醛固定，PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組取出并固定PRP凝膠-hTSCs復(fù)合物，石蠟包埋后切片，然后做甲苯胺藍(lán)染色。另一板細(xì)胞用胰酶消化后，分別收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 成軟骨分化染色實(shí)驗(yàn)

“1.2.4”中的control組、TGF-β3組細(xì)胞，蒸餾水漂洗后，加入甲苯胺藍(lán)染色液侵染30min，蒸餾水漂洗后在顯微鏡下觀察，PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組石蠟切片，經(jīng)脫蠟、透明、梯度酒精(由高到低)浸泡、蒸餾水漂洗后，加入甲苯胺藍(lán)染色液侵染30 min，蒸餾水漂洗、梯度酒精(由低到高)脫水、透明后封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 Sox9、CollagenⅡ表達(dá)的檢測(cè)

“1.2.4”中收集的細(xì)胞，加入RNAiso Plus提取總RNA、操作步驟參照說(shuō)明書(shū)，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以GADPH為內(nèi)參基因，操作步驟、反應(yīng)體系的配制、反映條件的設(shè)定依照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，qRT-PCR引物序列見(jiàn)表1，以2-ΔΔCt的算法對(duì)各組兩種基因mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer Sequence of qRT-PCR

“1.2.4”中收集的各組細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液吹打均勻，在4 ℃下裂解2 h、以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，收集上清，以BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，操作步驟參照說(shuō)明書(shū)，調(diào)整各組蛋白濃度使之相同，根據(jù)目的蛋白分子量配制適宜濃度的SDS-PAGE膠，在電泳儀中對(duì)各組20 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)移目的蛋白至PVDF膜上，加入5 %脫脂牛奶，室溫封閉1.5 h，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST溶液漂洗，加入羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，TBST溶液漂洗，采用ECL顯色，將條帶置于凝膠成像儀中觀察蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 hTSCs的鑒定結(jié)果

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，體外分離培養(yǎng)傳代的hTSCs CD29、CD90標(biāo)志抗原的表達(dá)分別達(dá)到99.08 %、99.88 %，而CD34、CD45、CD133標(biāo)志抗原的表達(dá)分別僅為0.08 %、0.09 %，見(jiàn)圖1，表明本研究分離培養(yǎng)傳代的hTSCs是高純度的肌腱干細(xì)胞。

圖1 hDPSCs的流式細(xì)胞鑒定結(jié)果Fig.1 Flow cytometric identification of hDPSCs

2.2 PRP凝膠的細(xì)胞相容性

對(duì)PRP凝膠進(jìn)行掃描電鏡觀察，可見(jiàn)PRP凝膠形成了立體網(wǎng)狀的三維結(jié)構(gòu)，凝膠的框架由纖維素組成，該結(jié)構(gòu)孔隙均勻，血小板在其中均勻分布，且附著良好。PRP凝膠-hTSCs細(xì)胞復(fù)合物也為立體網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)，在其中，hTSCs細(xì)胞牢牢附著在纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，并且生長(zhǎng)情況良好。Control組及PRP凝膠組細(xì)胞在7 d后增殖趨于穩(wěn)定，與control相比，PRP凝膠處理的hTSCs相對(duì)增值率呈上升趨勢(shì)，在7 d后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2、3。

PRP凝膠三維結(jié)構(gòu)

PRP凝膠TSCs復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)

圖3 PRP凝膠對(duì)hTSCs增殖的影響Fig.3 Effect of PRP gel on hTSCs proliferation

2.3 PRP凝膠聯(lián)合TGF-β3對(duì)肌腱干細(xì)胞成軟骨分化的影響

與control組相比，TGF-β3組、PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組細(xì)胞成軟骨細(xì)胞比例增加(P<0.05)；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，PRP凝膠+ TGF-β3組細(xì)胞成軟骨細(xì)胞比例均增加(P<0.05)，見(jiàn)圖4、5。

圖4 各組肌腱干細(xì)胞成軟骨分化結(jié)果(×200)Fig.4 Chondrogenic differentiation of tendon stem cells in each group(×200)

圖5 各組肌腱干細(xì)胞成軟骨分化細(xì)胞比例Fig.5 Proportion of chondrogenic differentiation cells of tendon stem cells in each group

注 A：control組；B：PRP凝膠組；C：TGF-β3組；D：PRP凝膠+ TGF-β3組。與control組相比，aP<0.05；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，bP<0.05。

2.4 各組hTSCs Sox9、CollagenⅡmRNA的表達(dá)

與control組相比，TGF-β3組、PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組細(xì)胞Sox9、CollagenⅡmRNA的相對(duì)表達(dá)量增加(P<0.05)；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，PRP凝膠+ TGF-β3組細(xì)胞Sox9、CollagenⅡmRNA的相對(duì)表達(dá)量均增加(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖6 各組細(xì)胞Sox9、CollagenⅡmRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of Sox9 and Collagen II in cells of each group

注 A：control組；B：PRP凝膠組；C：TGF-β3組；D：PRP凝膠+ TGF-β3組。與control組相比，aP<0.05；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，bP<0.05。

2.5 各組hTSCs Sox9、CollagenⅡ蛋白的表達(dá)

與control組相比，TGF-β3組、PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組細(xì)胞Sox9、CollagenⅡ蛋白的相對(duì)表達(dá)量增加(P<0.05)；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，PRP凝膠+ TGF-β3組細(xì)胞Sox9、CollagenⅡ蛋白的相對(duì)表達(dá)量均增加(P<0.05)，見(jiàn)圖7、8。

圖7 各組細(xì)胞Sox9、CollagenⅡ蛋白的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果
Fig.7 Immunoblotting results of Sox9 and Collagen Ⅱ proteins in cells of each group

圖8 各組細(xì)胞Sox9、CollagenⅡ蛋白的相對(duì)表達(dá)量
Fig.8 Relative expression of Sox9 and Collagen Ⅱ proteins in cells of each group

注 A：control組；B：PRP凝膠組；C：TGF-β3組；D：PRP凝膠+ TGF-β3組。與control組相比，aP<0.05；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，bP<0.05。

3 討論

椎間盤(pán)退變的主要機(jī)制是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分Ⅱ型膠原及蛋白聚糖含量減少，進(jìn)而造成椎間盤(pán)高度逐漸降低，同時(shí)引起椎間盤(pán)負(fù)重關(guān)節(jié)面及其他結(jié)構(gòu)也發(fā)生相應(yīng)改變，因細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分與軟骨細(xì)胞成分相類似[14]，通過(guò)組織工程技術(shù)促使種子細(xì)胞向軟骨分化提高椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)的含量，是預(yù)防和治療椎間盤(pán)退變的一條重要策略。性能優(yōu)良的支架材料及合適的種子細(xì)胞的選取是目前構(gòu)建可注射組織工程骨的關(guān)鍵步驟，肌腱干細(xì)胞(TSCs)是2007年學(xué)者首次從肌腱中分離出的能自我更新的細(xì)胞，該細(xì)胞具有多向分化潛能，即可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化，可作為組織工程技術(shù)中合適的種子細(xì)胞[15]。研究表明，TSCs在體外培養(yǎng)時(shí)相比種子細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)表現(xiàn)出更快地增殖速度以及更高的分化潛能，取代BMSCs作為股骨頭壞死組織修復(fù)中的種子細(xì)胞，治療股骨頭壞死療效更好[16]。PRP凝膠是自體血液兩次離心后，激活得到的具有三維立體結(jié)果的膠體，無(wú)免疫源性，是組織工程技術(shù)中良好的支架材料，含有高濃度的血小板及大量的生長(zhǎng)因子，有利于促進(jìn)種子細(xì)胞增殖、分化[17]。研究表明，PRP作為支架材料，和BMSCs具有良好的生物相容性，并能在一定程度上促進(jìn)BMSCs成軟骨分化[18]，TSCs分化時(shí)受到生物活性因子、細(xì)胞外基質(zhì)的改變、生物支架材料的選擇等多種因素的影響[19]，因而預(yù)計(jì)PRP凝膠可能促TSCs成軟骨分化。研究表明，TGF-β3可介導(dǎo)大鼠跟腱來(lái)源肌腱干細(xì)胞多方向分化，短時(shí)間、低濃度的TGF-β3刺激會(huì)抑制TSCs向非肌腱方向分化，而高濃度、長(zhǎng)時(shí)間TGF-β3刺激會(huì)促進(jìn)其向成骨、成軟骨等方向分化[20]，但PRP凝膠聯(lián)合TGF-β3對(duì)肌腱干細(xì)胞成軟骨分化的影響目前并不明確，本研究分離、培養(yǎng)了人肌腱中TSCs，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞表面抗原，結(jié)果顯示細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物CD29和CD90，與BMSCs表面標(biāo)記物相似，而造血干/祖細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34、血管內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物CD106的表達(dá)呈陰性，表明本研究提取的TSCs非血液細(xì)胞來(lái)源，且未受其污染，揭示本研究從人肌腱中分離、培養(yǎng)出了高純度的TSCs，為后續(xù)研究打下了良好的基礎(chǔ)。后續(xù)研究結(jié)果顯示，PRP凝膠具有良好的細(xì)胞相容性，并對(duì)hTSCs有一定的促增殖作用。與control組相比，TGF-β3組、PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組細(xì)胞成軟骨細(xì)胞比例、Sox9、CollagenⅡ表達(dá)均增加；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，PRP凝膠+ TGF-β3組細(xì)胞成軟骨細(xì)胞比例、Sox9、CollagenⅡ表達(dá)均增加。表明PRP凝膠和hTSCs具有良好的生物相容性，可促其增殖，和TGF-β3相同，可促其成軟骨分化，兩者聯(lián)合其促成軟骨分化作用進(jìn)一步增強(qiáng)。揭示PRP凝膠和hTSCs可能是構(gòu)建可注射組織工程骨合適的支架材料及種子細(xì)胞，TGF-β3可促進(jìn)其成軟骨分化。

綜上所述，PRP凝膠、TGF-β3都對(duì)人肌腱干細(xì)胞的成軟骨分化能力有促進(jìn)作用，兩者聯(lián)合具有協(xié)調(diào)作用，這為臨床上利用組織工程技術(shù)預(yù)防和治療椎間盤(pán)退變，構(gòu)建組織工程骨，修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷、股骨頭壞死等提供了新的參考，但PRP凝膠聯(lián)合TGF-β3對(duì)hTSCs成骨、成脂分化的影響本研究未進(jìn)行探討，還需要進(jìn)一步的深入研究。