卜易瑩 韓東興 劉邦令

摘要：目的? 探討乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者血清miR-145的表達(dá)水平及其臨床意義。方法? 采集上海市建工醫(yī)院于2014年8月～2017年8月收治的160例乳腺癌患者的血清樣本，其中乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者與非骨轉(zhuǎn)移患者各80例。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測血清樣本中miR-145的表達(dá)水平，并分析其與有無骨轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移程度、骨痛程度的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果? 骨轉(zhuǎn)移患者血清中miR-145的相對表達(dá)量低于乳腺癌非骨轉(zhuǎn)移患者[（1.22±0.24）vs（2.57±0.38） ]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且miR-145的相對表達(dá)量與患者的骨轉(zhuǎn)移程度（r=-0.873）、骨痛程度（r=-0.685）呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者血清miR-145的表達(dá)量明顯降低，且與病情呈負(fù)相關(guān)，miR-145可作為診斷及病情評估指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：miR-145;乳腺癌;骨轉(zhuǎn)移

中圖分類號：R737.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.07.002

文章編號：1006-1959（2019）07-0005-03

Abstract：Objective? To investigate the expression level of serum miR-145 in patients with breast cancer and its clinical significance. Methods? Serum samples of 160 breast cancer patients admitted to Shanghai Construction Engineering Hospital from August 2014 to August 2017 were collected， including 80 patients with breast cancer metastasis and non-bone metastasis. Real-time quantitative PCR was used to detect the expression level of miR-145 in serum samples， and its correlation with bone metastasis， bone metastasis and bone pain was analyzed. Results? The relative expression of miR-145 in patients with bone metastases was lower than that in patients with non-bone metastases [（1.22±0.24） vs （2.57±0.38）]， the difference was statistically significant （P<0.05）; and miR-145 The relative expression was negatively correlated with the degree of bone metastasis （r=-0.873） and the degree of bone pain （r=-0.685）， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? The expression of serum miR-145 is significantly decreased in patients with bone metastasis from breast cancer， and it is negatively correlated with the condition. miR-145 can be used as a diagnostic and disease assessment index.

Key words：miR-145;Breast cancer;Bone metastasis

乳腺癌（breast cancer）是發(fā)生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是目前全球女性最常見的惡性腫瘤之一，占女性腫瘤總發(fā)病率的30%[1，2]。盡管隨著乳腺癌根治術(shù)技術(shù)的不斷提高及各種靶向性藥物的應(yīng)用，乳腺癌患者的生存率及生活質(zhì)量都有了顯著提高，但其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍是影響患者預(yù)后的主要因素。其中尤以骨轉(zhuǎn)移最為常見，其發(fā)生率遠(yuǎn)高于肺、肝轉(zhuǎn)移。有研究表明以骨轉(zhuǎn)移為首發(fā)癥狀患者占27%～50%，乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)性患者2年內(nèi)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的概率高達(dá)63.4%[3，4]，骨轉(zhuǎn)移早期癥狀不典型，診斷困難，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已喪失最佳治療時(shí)機(jī)，且病情進(jìn)展迅速，其5年生存率僅有20%[5]。因此，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)室生化檢查有極大的臨床意義，是近年來的研究熱點(diǎn)。微小RNA（miR）是一類高度保守的由18～22個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼RNA。其經(jīng)由Dicer酶完成miR前體到成熟體的轉(zhuǎn)化[6，7]。miR通過結(jié)合于mRNA的3'末端的非編碼區(qū)從而抑制靶mRNA的翻譯發(fā)揮調(diào)控靶基因表達(dá)的作用[8]。差異性表達(dá)的mRNA廣泛參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因此特異性表達(dá)mRNA也被認(rèn)為是腫瘤診斷、治療的新靶點(diǎn)。本研究探討了miR-145在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的表達(dá)量，以期為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷及治療靶點(diǎn)的篩查提供新的思路。

1資料與方法

1.1一般資料? 選取2014年8月～2017年8月于上海市建工醫(yī)院收治的160例乳腺癌患者，均為女性，按照是否存在骨轉(zhuǎn)移分為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組及乳腺癌非骨轉(zhuǎn)移組，各80例。其中乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組，年齡31～74歲，平均年齡（52.57±6.36）歲，病程9個(gè)月～9年6個(gè)月，平均病程（5.20±2.61）年;乳腺癌非骨轉(zhuǎn)移組，年齡32～77歲，平均年齡（57.70±5.25）歲，病程7個(gè)月～9年3個(gè)月，平均病程（4.28±3.66）年。納入的所有患者原發(fā)灶均經(jīng)過穿刺活檢或病理切片檢查明確為乳腺癌，骨轉(zhuǎn)移病灶經(jīng)計(jì)算機(jī)斷層掃描、核磁共振成像或放射性核素掃描確認(rèn)至少有1處轉(zhuǎn)移灶。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集? 所有血清標(biāo)本均于患者明確診斷后未行手術(shù)治療、放化療、內(nèi)分泌治療之前采集。使用不含抗凝劑的真空采血管采集 兩組患者外周靜脈血5 ml，于4℃下2500 r/min 離心15 min，取上層血清液移至不含RNA酶的凍存管中，置入-80℃冰箱保存。

1.2.2 RNA提取與miR-145實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測? 血清樣本中總RNA的提取采用Trizol試劑按操作說明書提取，采用Nano-Drop 2000檢測提取RNA的濃度并調(diào)節(jié)濃度為200 ng/μL，取2 μL按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。每個(gè)樣本取2 μg，qPCR采用SYBR法檢測，反應(yīng)體系按上海生博生物公司mRNA熒光定量試劑盒操作規(guī)定進(jìn)行操作，qPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃ 10 min預(yù)變性， 94℃ 30 s變性，60℃ 1 min退火，共45個(gè)循環(huán)。將cDNA于ABI Prism7300型實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行qPCR檢測。miR-145上游引物：5'-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3'，下游引物：5'-GCTGTCAACATACGCTACGTAACG-3'。以U6為miR-145的內(nèi)參基因，所有反應(yīng)均設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，采用2-Ct計(jì)算相對表達(dá)量。

1.3觀察指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)? 比較兩組miR-145相對表達(dá)量，分析其與有無骨轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移程度、骨痛程度的相關(guān)關(guān)系。采用疼痛視覺模擬評分（VAS評分）評價(jià)骨痛程度，按疼痛嚴(yán)重程度分組，0～3分為輕度組、4～6分為中度組、7～10分為重度組。采用Soloway分級標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)腫瘤轉(zhuǎn)移程度及CT、MRI、PET-CT的檢查結(jié)果所顯示的骨轉(zhuǎn)移病灶數(shù)量不同，1～6個(gè)轉(zhuǎn)移灶為1級、7～20個(gè)轉(zhuǎn)移灶為2級、>20個(gè)轉(zhuǎn)移灶為3級。所有患者均經(jīng)過12～36個(gè)月隨訪觀察。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 采用SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Spearman分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 miR-145在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移與非骨轉(zhuǎn)移患者血清樣本中的差異表達(dá)? qPCR結(jié)果顯示，miR-145在兩組患者血清樣本中均有表達(dá)，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組患者血清miR-145相對表達(dá)量為（1.22±0.24）低于乳腺癌非骨轉(zhuǎn)移組的（2.57±0.38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.96，P=0.02）。

2.2 miR-145相對表達(dá)量與骨轉(zhuǎn)移患者骨痛程度及骨轉(zhuǎn)移程度的相關(guān)性分析? 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-145與骨轉(zhuǎn)移患者的骨痛程度及骨轉(zhuǎn)移程度呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

3討論

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，在我國每年有近17萬女性罹患乳腺癌。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移灶。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移會導(dǎo)致病理性骨折、劇烈骨痛、神經(jīng)功能障礙嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，而其早期癥狀往往不明顯，一旦出現(xiàn)上述癥狀則多為疾病中晚期，臨床治療效果不佳。尋找一種簡單有效、且特異性高的實(shí)驗(yàn)室檢查方法對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的早期篩查有重要的臨床意義。Matamala N等[9]研究表明mRNA不僅僅在組織細(xì)胞中，而且在血清中也能穩(wěn)定存在。血清標(biāo)本比較容易獲得且近年來qPCR技術(shù)的日臻成熟，這就為利用mRNA表達(dá)篩查診斷乳腺癌骨轉(zhuǎn)移提供了比較可靠的技術(shù)路線。

Chang Y等[10]研究表明miR-145可通過調(diào)控MAP3K1來抑制非小細(xì)胞性肺癌的轉(zhuǎn)化進(jìn)程。Sheng N等[11]研究顯示miR-145表達(dá)可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲與遷移，其在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)。以上研究表明miR-145在惡性腫瘤的進(jìn)程中可以發(fā)揮抑制的作用，這也與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者血清中miR-145相對表達(dá)量低于非骨轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且miR-145相對表達(dá)量與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的骨轉(zhuǎn)移程度、骨痛程度呈負(fù)相關(guān)，miR-145相對表達(dá)量越低，患者的骨痛明顯，患者骨轉(zhuǎn)移程度越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示miR-145可能參與了乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程，包含miR-145在內(nèi)的miRNA家族參與多種生物學(xué)進(jìn)程，包括細(xì)胞的增殖、定向分化、凋亡等，其調(diào)控及表達(dá)異常均可導(dǎo)致細(xì)胞的病理進(jìn)程。生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)SOX11可能是miR-145作用的靶基因。SOX家族是在細(xì)胞生長中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的一組轉(zhuǎn)錄因子，SOX11在抑癌及促癌中的作用已被廣泛研究[12，13]。但miR-145通過靶向調(diào)節(jié)SOX11及其下游關(guān)于腫瘤骨轉(zhuǎn)移的具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，miR-145在在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者血清中的相對表達(dá)量相較于非骨轉(zhuǎn)移患者顯著下調(diào)，且其下調(diào)程度與骨痛程度及轉(zhuǎn)移程度均呈相關(guān)性，miR-145可作為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的潛在診斷與篩查方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sigel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2016[J].CA Cancer J Clin，2016，66（1）：7-30.

[2]Futakuchi M，Singh RK.Animal model for mammary tumor growth in the bone microenvironment[J].Breast Cancer，2013，20（3）：195-203.

[3]Xiao W，Zou Y，Zheng S，et al.Primary tumor resection in stage Ⅳ breast cancer：A systematic review and meta-analysis[J].European Journal of Surgical Oncology，2018，44（10）：1604-1512.

[4]Oruc Z，Kaplan MA，Arslan C.An update on the currently available and future chemotherapy for treating bone metastases in breast cancer patients[J].Expert Opinion on Pharmacother，2018，19（12）：1305-1316.

[5]Hofbauer LC，Rachner T，Singh SK.Fatal attraction：Why breast cancer cells home to bone[J].Breast Cancer Research，2008，10（1）：101.

[6]Hutvágner G，McLachlan J，Pasquinelli AE，et al.A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA[J].Science，2001，293（5531）：834-838.

[7]陳靚昱，張清媛.MicroRNA在乳腺癌內(nèi)分泌耐藥中的研究新進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2014，19（12）：1147-1150.

[8]Nakajima N，Takahashi T，Kitamura R，et al.MicroRNA-1 facilitates skeletal myogenic differentiation without affecting osteoblastic and adipogenic differentiation[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，350（4）：1006-1012.

[9]Matamala N，Vargas MT，González-Cámpora R，et al.Tumor microrRNA expression profiling identifies circulating microRNAs for early breast cancer detection[J].Clinical chemistry，2015，61（8）：1098-1106

[10]Chang Y， Yan W， Sun C，et al.miR-145-5p inhibits epithelial-mesenchymal transition via the JNK signaling pathway by targeting MAP3K1 in non-small cell lung cancer cells[J].Oncology Letters，2017，14（6）：6923-6928.

[11]Sheng N，Tan G，You W，et al.MiR-145 inhibits human colorectal cancer cell migration and invasion via PAK4-dependent pathway[J].Cancer Medicine，2017，6（6）：1331-1340.

[12]Jethon A，Pula B，Olbromski M，et al.Prognostic significance of SOX18 expression in non-small cell lung cancer[J].International Journal of Oncology，2015，46（1）：123-132.

[13]吳曉玲，厲云，李牧，等.Sox11在宮頸癌及其癌前病變中的表達(dá)及意義[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）2018，39（1）：73-77.

收稿日期：2019-2-18;修回日期：2019-2-28

編輯/杜帆