林 麗 王 軍 秦曉明

尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是人乳頭瘤病毒(HPV)感染導(dǎo)致的良性表皮增生或黏膜病變[1]，好發(fā)于生殖器、肛門等部位，主要?dú)w因于HPV6型或11型，尖銳濕疣具有傳染能力強(qiáng)、增生迅速等特點(diǎn)，復(fù)發(fā)率高達(dá)59%[2]。Livin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族成員之一，在調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期等方面起著關(guān)鍵作用[3]。Caspase-3是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族成員之一，具有介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，在多種腫瘤組織中低表達(dá)，可作為腫瘤預(yù)后的指標(biāo)之一[4]。對(duì)于Livin和Caspase-3在CA初發(fā)患者皮損中表達(dá)的研究較少，本研究通過(guò)免疫組化法(Streptavidin-peroxidase，SP)檢測(cè)二者在CA初發(fā)患者皮損和正常包皮組織中的分布及表達(dá)情況，以探討二者在CA的發(fā)生與發(fā)展中可能的作用。

1 資料與方法

1.1 資料 30例CA組織標(biāo)本取自2016年7月至2017年9月于我院皮膚性病科門診就診，未經(jīng)過(guò)任何治療的初發(fā)患者，排除合并其他類型性病、嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病、腫瘤以及近半年使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物的患者，排除妊娠、哺乳期婦女，所有入選的患者皮損醋酸白實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，皮損經(jīng)組織病理證實(shí)為CA。其中男21例，女9例，男女比例為2.33∶1；患者年齡18～69歲，平均(39.30±15.19)歲；病程4天～7個(gè)月；男性皮損中位于肛周、冠狀溝、龜頭、陰莖的各8例、5例、3例、5例；女性皮損中位于肛周、外陰、會(huì)陰部的各2例、6例、1例。20例包皮組織取自同期于我院門診手術(shù)室行包皮環(huán)切術(shù)切除的正常包皮組織，患者年齡22～40歲，平均(31.70±5.49)歲。取材部位無(wú)紅腫、炎癥和破潰。

1.2 試劑 濃縮型兔抗人Livin和Caspase-3多克隆抗體原液，購(gòu)于華安生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒與免疫組化抗原修復(fù)緩沖液，購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Livin和Caspase-3抗體工作濃度分別為1∶700和1∶80。

1.3 免疫組化法(SP) 固定標(biāo)本，石蠟包埋組織，制作蠟塊，3.5 μm連續(xù)切片；烤片，脫蠟，脫二甲苯，水化，抗原熱修復(fù)；PBS緩沖液漂洗，滴加3% H2O2溶液，室溫下避光孵育10 min；PBS緩沖液漂洗；滴加Livin或Caspase-3一抗工作液，室溫下避光孵育2 h；PBS緩沖液漂洗；滴加免疫組化染色試劑，室溫下避光孵育30 min；PBS緩沖液漂洗；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，風(fēng)干，封片。選用由華安生物技術(shù)有限公司贈(zèng)送的已明確為陽(yáng)性染色的組織切片為陽(yáng)性對(duì)照；以PBS緩沖液代替一抗工作液進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)的組織切片為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 在顯微鏡下觀察到細(xì)胞核或者細(xì)胞漿染成淺黃色、棕黃色或者棕褐色，為染色陽(yáng)性。蛋白表達(dá)強(qiáng)度的評(píng)分等于染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分的乘積。于400倍的高倍鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[5]，染色強(qiáng)度根據(jù)細(xì)胞整體的著色程度分為IV級(jí)：I級(jí)—無(wú)染色，0分；II級(jí)—染成淺黃色，1分；III級(jí)—染成棕黃色，2分；IV級(jí)—染成棕褐色，3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比為陽(yáng)性細(xì)胞與總計(jì)數(shù)細(xì)胞的比值，分為V級(jí)：I級(jí)—比值為0%～10%，0分；II級(jí)—比值為11%～25%，1分；III級(jí)—比值為26%～50%，2分；IV級(jí)—比值為51%～75%，3分,V級(jí)—比值≥76%,4分。蛋白表達(dá)強(qiáng)度分為IV級(jí)：I級(jí)—陰性(-)，0分；II級(jí)—弱陽(yáng)性(+)，1～4分；III級(jí)—中等陽(yáng)性(++)，6～8分；IV級(jí)—強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，9～12分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Livin在初發(fā)性CA組織及正常包皮組織中的分布與表達(dá) Livin的陽(yáng)性分布：在胞漿和胞核內(nèi)可見(jiàn)淡黃色至棕褐色不等的著色，以棘層的中、上部和顆粒層為主。Livin在初發(fā)性尖銳濕疣組織、正常包皮組織中的陽(yáng)性與陰性的表達(dá)，見(jiàn)圖1a～2b。

在初發(fā)性CA組織中，Livin陽(yáng)性表達(dá)23例，陽(yáng)性表達(dá)率76.67%(23/30)。表達(dá)強(qiáng)度為陰性(-)、弱陽(yáng)性(+)、中等陽(yáng)性(++)、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)的各7例、2例、13例、8例，表達(dá)強(qiáng)度以中等陽(yáng)性(++)～強(qiáng)陽(yáng)性(+++)為主；在正常包皮組織中，Livin陽(yáng)性表達(dá)的5例，陽(yáng)性表達(dá)率25.00%(5/20)。表達(dá)強(qiáng)度為陰性(-)、弱陽(yáng)性(+)、中等陽(yáng)性(++)的各15例、3例、2例，表達(dá)強(qiáng)度以陰性(-)～中等陽(yáng)性(++)為主。Livin在初發(fā)性CA組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常包皮組織，兩組間陽(yáng)性表達(dá)率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.001，P<0.05)，Livin在初發(fā)性CA組織中的表達(dá)強(qiáng)度高于正常包皮組織，兩組間陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=4.057，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 Livin在初發(fā)性尖銳濕疣組和正常對(duì)照組中的表達(dá) 例

2.2 Caspase-3在初發(fā)性CA組織及正常包皮組織中的分布與表達(dá) Caspase-3的陽(yáng)性分布：在胞漿和胞核內(nèi)可見(jiàn)棕黃色至棕褐色不等的著色，以棘層和顆粒層為主。Caspase-3在初發(fā)性尖銳濕疣組織、正常包皮組織中的陽(yáng)性與陰性的表達(dá)，見(jiàn)圖3a～4b。

在初發(fā)性CA組織中，Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)的13例，陽(yáng)性表達(dá)率43.33%(13/30)。表達(dá)強(qiáng)度為陰性(-)、弱陽(yáng)性(+)、中等陽(yáng)性(++)的各17例、9例、4例，表達(dá)強(qiáng)度以陰性(-)～中等陽(yáng)性(++)為主；在正常包皮組織中，Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)的14例，陽(yáng)性表達(dá)率70.00%(14/20)。表達(dá)強(qiáng)度為陰性(-)、弱陽(yáng)性(+)、中等陽(yáng)性(++)、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)的各6例、2例、8例、4例，表達(dá)強(qiáng)度以中等陽(yáng)性(++)～強(qiáng)陽(yáng)性(+++)為主。Caspase-3在初發(fā)性CA組織中的陽(yáng)性表達(dá)率低于正常包皮組織，兩組間陽(yáng)性表達(dá)率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.435，P>0.05)，Caspase-3在初發(fā)性CA組織中表達(dá)強(qiáng)度低于正常包皮組織，兩組間陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=2.906，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 Caspase-3在初發(fā)性尖銳濕疣組和對(duì)照組中的表達(dá) 例

2.3 Livin、Caspase-3在初發(fā)性CA組織中表達(dá)的關(guān)系 對(duì)Livin、Caspase-3在初發(fā)性CA組織中的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者在初發(fā)性CA組織中的表達(dá)強(qiáng)度之間無(wú)相關(guān)性(r=0.238，P>0.05)。見(jiàn)表3。

圖11a:Livin在初發(fā)性尖銳濕疣組織中的陽(yáng)性表達(dá)(SP，×400)；1b:Livin在初發(fā)性尖銳濕疣組織中的陰性表達(dá)(SP,×400)

圖22a:Livin在正常包皮組織中的陽(yáng)性表達(dá)(SP，×400)；2b:Livin在正常包皮組織中的陰性表達(dá)(SP，×400)

圖33a:Caspase-3在初發(fā)尖銳濕疣組織中的陽(yáng)性表達(dá)(SP，×400)；3b:Caspase-3在初發(fā)尖銳濕疣組織中的陰性表達(dá)(SP，×400)

圖44a:Caspase-3在正常包皮組織中的陽(yáng)性表達(dá)(SP，×400)；4b:Caspase-3在正常包皮組織中的陰性表達(dá)(SP，×400)

表3 初發(fā)性尖銳濕疣組中Livin、Caspase-3表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性 例

3 討論

對(duì)于尖銳濕疣的治療，可選擇的治療方法種類繁多，但本病的高復(fù)發(fā)率仍然是臨床治療上的難題。 Livin是通過(guò)IAP同源序列從人類基因組cDNA文庫(kù)中克隆得到的，在多種腫瘤組織中可見(jiàn)Livin的高度表達(dá)[6]。Livin通過(guò)對(duì)Caspase家族的抑制、對(duì)TAK1/JNK1信號(hào)傳導(dǎo)的激活以及通過(guò)Smac調(diào)控Livin的活性三種途徑發(fā)揮對(duì)抗細(xì)胞凋亡的作用，其中對(duì)Caspase家族的抑制為主要途徑[7]。Zhou等[6]發(fā)現(xiàn)Livin可作為黑素瘤的免疫標(biāo)記和治療的靶點(diǎn)，通過(guò)干擾腫瘤細(xì)胞中Livin的合成，降低Livin的活性，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。通過(guò)下調(diào)Livin的表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡和化療藥物的敏感性增加，縮小腫瘤的體積，Livin是未來(lái)腫瘤特異性治療的新靶點(diǎn)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)Livin在CA初發(fā)患者皮損中的陽(yáng)性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度均高于正常包皮組織，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，在CA初發(fā)患者皮損中存在Livin的高表達(dá)，Livin的過(guò)度表達(dá)可能通過(guò)干擾細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致尖銳濕疣組織的異常增殖。

Caspase-3位于細(xì)胞凋亡反應(yīng)的下游，Caspase-3被激活后可導(dǎo)致多種蛋白質(zhì)失去正常的活性，阻滯細(xì)胞周期、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、干擾細(xì)胞修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜破裂、染色質(zhì)異常聚集等形態(tài)學(xué)改變及誘導(dǎo)凋亡小體的形成，從而發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及抑制細(xì)胞增殖的作用[10]。Hua等[11]發(fā)現(xiàn)沉默Caspase-3的表達(dá)后，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞增殖、提高細(xì)胞抗凋亡能力,Caspase-3與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3在CA初發(fā)患者皮損中的陽(yáng)性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度均低于正常包皮組織,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12],在CA初發(fā)患者皮損中存在Caspase-3的低表達(dá)，Caspase-3表達(dá)的下調(diào)，抑制了細(xì)胞正常的凋亡途徑，Caspase-3失去了對(duì)細(xì)胞正常增殖的調(diào)控作用，導(dǎo)致CA組織的異常增殖。

在多種腫瘤組織中存在Livin的高表達(dá)與Caspase-3的低表達(dá)，Livin抑制Caspase-3的表達(dá)，二者在腫瘤組織中的表達(dá)多呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)下調(diào)Livin表達(dá)、上調(diào)Caspase-3表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤組織的增殖，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[13]。本研究中二者在CA初發(fā)患者皮損中的表達(dá)強(qiáng)度之間無(wú)相關(guān)性，CA與皮膚腫瘤在易反復(fù)發(fā)生、有癌變的可能、伴有表皮細(xì)胞增殖、真皮毛細(xì)血管增多等臨床特點(diǎn)及病理特征方面相似[14]，疣體的增殖無(wú)惡性腫瘤無(wú)限增殖的特征，經(jīng)過(guò)治療，可達(dá)到臨床治愈。

在CA初發(fā)患者皮損中存在Livin的高表達(dá)與Caspase-3的低表達(dá)，二者可能通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡途徑的抑制，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，二者共同參與了尖銳濕疣的發(fā)生與發(fā)展。通過(guò)下調(diào)CA組織中Livin的表達(dá)、上調(diào)Caspase-3的表達(dá)，以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡和抑制細(xì)胞的增殖。對(duì)于二者在CA初發(fā)性與復(fù)發(fā)性患者皮損中的表達(dá)是否存在差異，二者在CA組織中的表達(dá)與HPV的感染類型是否有關(guān)，仍需在今后的工作中進(jìn)一步研究驗(yàn)證。