李偉 王歡 姚海 楊解人

摘要：目的? 探討芝麻素（Ses）對(duì)大鼠化學(xué)性心肌損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法? SD大鼠30只，隨機(jī)分為正常組、模型組和Ses組，每組10只。模型組和Ses組SD大鼠給予D-半乳糖[180 mg·（kg·d），i.p.]和三氯化鋁[15 mg/（kg·d），i.g.]造模12周，Ses組于第13周給予Ses[160 mg/（kg·d），i.g.]治療，連續(xù)8周，正常組給予生理鹽水[5.0 ml/（kg·d），i.g.]。末次給藥后稱體重（BW）和全心濕重（HWW）;HE染色觀察心肌病理組織學(xué)變化;免疫組化檢測(cè)心肌iNOS蛋白表達(dá)。結(jié)果? 模型組HWW和HWI高于正常組（P<0.01），Ses組HWW和HWI均低于模型組（P<0.05）;光鏡下觀察，正常組大鼠心肌細(xì)胞間隙、組織形態(tài)正常，呈長(zhǎng)梭形，心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰整齊。模型組心肌細(xì)胞增生肥大，心肌纖維增粗且排列紊亂，細(xì)胞核增大。與模型組相比，Ses組心肌細(xì)胞增生均有不同程度的改善，心肌纖維排列較為整齊，細(xì)胞間隙小于模型組;免疫組化圖像顯示iNOS蛋白主要表達(dá)于心肌細(xì)胞胞漿中。與正常組相比，模型組iNOS蛋白明顯升高（P<0.01）;與模型組相比，Ses組心肌iNOS蛋白表達(dá)降低（P<0.01）。結(jié)論? Ses能下調(diào)iNOS蛋白表達(dá)，減少NO產(chǎn)生，提高抗氧化能力，發(fā)揮保護(hù)心肌損傷的作用。

關(guān)鍵詞：芝麻素;心肌;iNOS;化學(xué)性心肌損傷

中圖分類號(hào)：R285.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.08.001

文章編號(hào)：1006-1959（2019）08-0001-03

Abstract：Objective? To investigate the protective effect and possible mechanism of sesamin （Ses） on chemical myocardial injury in rats. Methods? 30 SD rats were randomly divided into normal group， model group and Ses group， with 10 rats in each group. Two groups of SD rats were given D-galactose [180 mg·（kg·d），i.p.] and aluminum trichloride [15 mg/（kg·d），i.g.] for 12 weeks. The Ses group was treated with Ses [160 mg/（kg·d），i.g.] at the 13th week for 8 weeks and the normal group [5.0 ml/（kg·d），i.g.]. Body weight （BW） and whole heart wet weight （HWW） were measured after the last administration; myocardial histopathological changes were observed by HE staining; myocardial iNOS protein expression was detected by immunohistochemistry. Results? HWW and HWI in the model group were higher than those in the normal group （P<0.01）. The HWW and HWI in the Ses group were lower than those in the model group （P<0.05）. Under the light microscope， the myocardial cell gap and tissue morphology in the normal group were normal. Long fusiform， myocardial fiber structure is clear and tidy. In the model group， the cardiomyocytes proliferated and hypertrophied， the myocardial fibers were thickened and arranged disorderly， and the nucleus increased. Compared with the model group， the myocardial cell proliferation in the Ses group was improved to some extent. The myocardial fibers were arranged neatly and the cell gap was smaller than that in the model group. Immunohistochemical images showed that iNOS protein was mainly expressed in the cytoplasm of cardiomyocytes. Compared with the normal group， the iNOS protein in the model group was significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， the expression of iNOS protein in the Ses group was decreased （P<0.01）. Conclusion? Ses can down-regulate the expression of iNOS protein， reduce the production of NO， increase the antioxidant capacity， and play a role in protecting myocardial injury.

Key words：Sesamin;Myocardium;iNOS;Chemical myocardial injury

芝麻素（sesamin，Ses）是從芝麻中提取的有效成分，具有降壓、降脂、抗氧化等[1，2]作用。研究表明芝麻素能改善心肌和血管的肥厚[3]，本課題組前期研究也表明，芝麻素能防止自發(fā)性高血壓大鼠左心室重構(gòu)[4]，逆轉(zhuǎn)腎性高血壓大鼠心肌肥厚[5]，改善代謝綜合癥大鼠心肌損傷[6]。但對(duì)D-半乳糖和三氯化鋁引起的心肌損傷未見(jiàn)報(bào)道，因此，本研究探討芝麻素的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑? 清潔級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，體重180～220g，雌雄各半。購(gòu)于蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2009-0002，大鼠自然光照，室溫（23±2）℃，相對(duì)濕度60%～65%，自由進(jìn)食和飲水。芝麻素，純度93.7%，分子式C20H15O6，分子量354.34，上海純優(yōu)生物科技有限公司;三氯化鋁，批號(hào)：20110506，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;D-半乳糖，分子式C6H12O6，分子量180.1，北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司;SABC免疫組化試劑盒和iNOS一抗，購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司;山羊抗小鼠HRP二抗、山羊抗兔HRP二抗，購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2分組與給藥? SD大鼠30只，隨機(jī)分為正常組、模型組和Ses組，每組10只。除正常組給予生理鹽水[5.0 ml/（kg·d），i.g.]外，余各組給予D-半乳糖[180 mg/（kg·d），i.p.]和三氯化鋁[15 mg/（kg·d），i.g.]，造模12周，Ses組于第13周給予Ses [160 mg/（kg·d），i.g.]治療8周。

1.3 HE染色? 于末次給藥后，禁食12 h，3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，開胸，取心臟，取心肌組織相同部位，多聚甲醛固定，包埋，切片5 μm/片，常規(guī)脫水，蘇木精染色5 min，1%鹽酸酒精分化15 s，流水沖洗，伊紅染色2 min，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.3 HE染色? 取心肌組織相同部位，多聚甲醛固定，包埋，切片5 μm/片，常規(guī)脫水，蘇木精染色5 min，1%鹽酸酒精分化15 s，流水沖洗，伊紅染色2 min，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.4免疫組化檢測(cè)心肌iNOS蛋白表達(dá)? 心肌組織切片，厚度約5 μm/片，常規(guī)脫蠟。枸櫞酸鹽緩沖液微波爐高火2.5 min，再低火12 min以熱修復(fù)抗原，室溫冷卻。雙蒸水洗3次，3% H2O2 滅活內(nèi)源性酶37℃ 15 min。0.5% Trionx-100 （PBS配） 洗四次，5% BSA 封閉液37℃ 1 h，滴加兔抗大鼠NOS2（1：300），4℃過(guò)夜。37℃孵育1 h，加生物素化山羊抗兔lgG 二抗（1：100）。37℃孵育2 h，PBS洗3次，加SABC （1：100） 37℃ 1 h，PBS洗4次，DAB顯色，烤干，透明和封片。

1.5評(píng)價(jià)指標(biāo)? 于末次給藥后，禁食12 h，稱體重（BW），稱全心濕重（heart wet weight，HWW），計(jì)算心肌臟器系數(shù)（heart weight index，HWI），HWI=HWW/BW。心肌iNOS免疫組化圖像使用Image-pro plus 6.0 軟件進(jìn)行半定量分析，陽(yáng)性表達(dá)水平用積分光密度值（IOD）表示。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理? 采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析，計(jì)量資料使用（x±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2結(jié)果

2.1各組大鼠BW、HWW和HWI比較? 模型組HWW和HWI高于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01），Ses組HWW和HWI均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2芝麻素對(duì)心肌組織形態(tài)比較? 光鏡下觀察，正常組大鼠心肌細(xì)胞間隙、組織形態(tài)正常，呈長(zhǎng)梭形，心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰整齊。模型組心肌細(xì)胞增生肥大，心肌纖維增粗且排列紊亂，細(xì)胞核增大，說(shuō)明心肌細(xì)胞具有病理?yè)p傷。與模型組相比，Ses組心肌細(xì)胞增生均有不同程度的改善，心肌纖維排列較為整齊，細(xì)胞間隙小于模型組，見(jiàn)圖1。

2.3芝麻素對(duì)心肌iNOS蛋白表達(dá)? 免疫組化圖像顯示iNOS蛋白主要表達(dá)于心肌細(xì)胞胞漿中，呈棕黃色顆粒。與正常組相比，模型組iNOS蛋白表達(dá)升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01）;與模型組相比，Ses組心肌iNOS蛋白表達(dá)降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01），見(jiàn)圖2。

3討論

D-半乳糖和三氯化鋁常用于制備動(dòng)物阿爾茨海默癥模型。本課題組前期在使用D-半乳糖和三氯化鋁來(lái)誘導(dǎo)大鼠阿爾茨海默癥模型時(shí)[7]，偶然發(fā)現(xiàn)大鼠的HWW和HWI增加，經(jīng)HE染色證明心肌細(xì)胞伴有增生肥大，心肌纖維增粗排列紊亂，細(xì)胞核增大，提示D-半乳糖和三氯化鋁長(zhǎng)期攝入不僅可以復(fù)制大鼠阿爾茨海默癥模型，同時(shí)可以誘導(dǎo)化學(xué)性心肌損傷模型。給予模型大鼠口服Ses治療8周后，發(fā)現(xiàn)HWW和HWI減輕，光鏡下顯示心肌細(xì)胞病理性改變有不同程度的改善，說(shuō)明Ses能降低心肌HWW和HWI，對(duì)心肌損傷具有保護(hù)作用。

文獻(xiàn)報(bào)道D-半乳糖和鋁長(zhǎng)期攝入過(guò)量，會(huì)改變滲透壓，產(chǎn)生過(guò)量活性氧，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白變性，引起腦功能減退，與阿爾茨海默癥的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[8，9]。但對(duì)其誘導(dǎo)的化學(xué)性心肌損傷的發(fā)生和發(fā)展是否與氧化應(yīng)激有關(guān)未見(jiàn)報(bào)道，故我們從氧化應(yīng)激角度出發(fā)。在病理?xiàng)l件下，NO主要來(lái)至iNOS的合成，通過(guò)免疫組化方法，觀察到模型大鼠iNOS陽(yáng)性蛋白顆粒明顯增強(qiáng)，由此可證明D-半乳糖和三氯化鋁引起的氧化應(yīng)激與誘導(dǎo)iNOS蛋白表達(dá)，從而增加NO合成有關(guān)，當(dāng)給予Ses治療以后，iNOS的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，說(shuō)明模型大鼠心肌存在明顯氧化應(yīng)激損傷，Ses具有抗氧化能力，其機(jī)制可能與下調(diào)iNOS的蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，Ses對(duì)D-半乳糖和三氯化鋁誘導(dǎo)大鼠的化學(xué)性心肌損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)心肌iNOS 蛋白表達(dá)，減少NO，從而發(fā)揮抗氧化能力，確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2019-1-23;修回日期：2019-1-30

編輯/宋偉

基金項(xiàng)目：安徽省優(yōu)秀青年人才基金（編號(hào)：2012SQRL124）

作者簡(jiǎn)介：李偉（1989.3-），男，安徽蚌埠人，碩士，藥師，主要從事臨床藥理學(xué)方面的研究

通訊作者：楊解人（1955.2-），女，上海人，本科，教授，主要從事臨床藥理學(xué)方面的研究