吳曉君，王少輝，楊登輝，王 棟，田明星，丁 鏟，高 崧，于圣青

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

沙門(mén)菌（Salmonella）屬腸桿菌科，是一種很常見(jiàn)的革蘭陰性桿菌，宿主十分廣泛。沙門(mén)菌感染人和動(dòng)物后引發(fā)沙門(mén)菌病，臨床癥狀主要是敗血癥和胃腸炎等中毒癥狀。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界各地由沙門(mén)菌引起的食物中毒位居榜首[1-2]。近年來(lái)，美國(guó)[3]、澳大利亞[4]、瑞士[5]等國(guó)家爆發(fā)了不同規(guī)模的沙門(mén)菌感染。沙門(mén)菌還可引起多種畜禽疾病[6-7]，如雞白痢、雞傷寒、雞副傷寒、豬副傷寒等，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，有效地鑒定和控制沙門(mén)菌的傳播已成為重中之重。本研究對(duì)華東地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)中沙門(mén)菌的流行情況及其耐藥性進(jìn)行了分析，為預(yù)防和控制沙門(mén)菌的流行及傳播提供參考。

1 材料和方法

1.1 試劑、材料和儀器 2×PCRmix、DNA Marker購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；藥敏片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR儀購(gòu)自ABI公司；核酸電泳儀及全自動(dòng)凝膠成像處理系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司；4℃臺(tái)式離心機(jī)及小型高速離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司。

1.2 病料來(lái)源 2015年4月～2017年6月于上海市、江蘇省、安徽省、浙江省等地4家豬場(chǎng)、2家雞場(chǎng)采集糞便樣品和肛拭子樣品共285份。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中公布的沙門(mén)菌基因組，設(shè)計(jì)沙門(mén)菌鑒定引物、血清學(xué)鑒定引物及毒力基因檢測(cè)引物（表1）。引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行合成。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將樣品和肛拭子樣品混于500 μL緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW培養(yǎng)基）中，37℃培養(yǎng)增菌8～12 h；劃線接種于沙門(mén)菌SS培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16～20 h；挑取疑似單菌落在平板上劃線純化，并挑取疑似單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6～8 h，進(jìn)行下一步鑒定。

1.5 沙門(mén)菌粗提DNA制備 取1 mL增菌液至無(wú)菌EP管中，18 000×g離心5 min，棄上清，加入100 μL滅菌去離子水，重懸沉淀，于沸水中加熱10 min，18 000×g離心5 min，收集上清液，作為PCR反應(yīng)模板。

1.6 沙門(mén)菌PCR鑒定 通過(guò)PCR擴(kuò)增沙門(mén)菌invA基因鑒定沙門(mén)菌，PCR反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix 10 μL、引物invA-F/R（表1）各1 μL、模板（上1.5中所提DNA）1 μL，最后加滅菌超純水至20 μL。同時(shí)設(shè)立陽(yáng)、陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性 30 s，50℃ 退火 30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外下拍照，記錄結(jié)果。

1.7 血清學(xué)鑒定 根據(jù)沙門(mén)菌血清型特異性基因設(shè)計(jì)沙門(mén)菌血清學(xué)鑒定引物speC-F/R、glgC-F/R、sdfI-F/R、spy-F/R（表1）[8]，建立PCR檢測(cè)方法，對(duì)沙門(mén)菌臨床分離株進(jìn)行血清學(xué)鑒定。

1.8 毒力基因檢測(cè) 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的沙門(mén)菌毒力基因檢測(cè)多重PCR方法[9]，對(duì)48株沙門(mén)菌分離株的毒力因子進(jìn)行多重PCR鑒定。

1.9 LD50測(cè)定 選取臨床分離株1～7接種于LB培養(yǎng)基至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前中期（OD600≈1.0），滅菌PBS洗滌菌體2次后稀釋至含菌量為104～107/0.2 mL。選取140只6周齡ICR清潔級(jí)小鼠，隨機(jī)分成28組，每組5只。臨床分離株1接種1～4組，各組接種量依次為104、105、106、107CFU/只，臨床分離株2～7以此類(lèi)推。接種后連續(xù)觀察記錄14 d各組發(fā)病死亡情況，按改良寇氏法計(jì)算各菌株的LD50。

1.10 耐藥性檢測(cè) 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將所保存的沙門(mén)菌分離株分別在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h，致密劃線于瓊脂平板表面，用無(wú)菌鑷子將藥敏片貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)抑菌圈直徑，根據(jù)美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)判定沙門(mén)菌臨床分離株對(duì)藥敏紙片的敏感性。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 沙門(mén)菌的分離鑒定 沙門(mén)菌在SS培養(yǎng)基上形成呈中間黑色、周?chē)该鲿灜h(huán)的菌落，其他細(xì)菌大多呈無(wú)色菌落。從分離菌株中挑取可疑菌落，通過(guò)PCR（invA基因，244 bp）鑒定沙門(mén)菌48株，分離率為16.84%。其中豬場(chǎng)分離37株，分離率為12.98%；雞場(chǎng)分離11株，分離率為3.85%。

2.2 血清學(xué)鑒定 對(duì)PCR鑒定呈陽(yáng)性的菌株進(jìn)行血清學(xué)鑒定，結(jié)果顯示31株沙門(mén)菌屬于鼠傷寒沙門(mén)菌，占64.58%，為主要血清型；腸炎沙門(mén)菌占6.25%（圖2），未發(fā)現(xiàn)雞傷寒和雞白痢沙門(mén)菌，其他血清型占29.17%。

圖1 沙門(mén)菌的PCR鑒定結(jié)果Fig. 1 Identifi cation of Salmonella by PCR amplifi cation

圖2 沙門(mén)菌血清型鑒定結(jié)果Fig. 2 Identifi cation of Salmonella serotype by PCR

2.3 毒力基因檢測(cè) 多重PCR和單基因PCR對(duì)48株沙門(mén)菌毒力基因的檢測(cè)結(jié)果一致。檢測(cè)結(jié)果顯示，sopE基因分布率最低，僅有25%；其余15個(gè)毒力基因分布廣泛，分別是：hilA（100%）、spiA（100%）、invA（100%）、ssrA（97.92%）、ssaR（100%）、spiC（100%）、sifA（100%）、mgtB（100%）、misL（100%）、shdA（100%）、siiD（97.92%）、pipA（100%）、pipB（100%）、sopB（100%）、pagN（100%）（表2）。

2.4 LD50測(cè)定 結(jié)果顯示，臨床分離株1-7的LD50分別為：1.26×104、1.26×104、5.01×104、5.01×104、5.01×104、1.26×105、2.00×105CFU（表3）。

表2 沙門(mén)菌毒力基因分布Table 2 Distribution of virulence genes in Salmonella

表3 沙門(mén)菌LD50測(cè)定Table 3 Salmonella LD50 determination

2.4 沙門(mén)菌耐藥性檢測(cè) 48株沙門(mén)菌對(duì)克林霉素、利福平、紅霉素、四環(huán)素、新霉素、復(fù)方新諾明、大觀霉素、阿奇霉素、氨 青霉素、氯霉素、頭孢拉定、頭孢噻吩、丙氟哌酸、菌必治的耐藥性分別為100%、100%、97.92%、79.17%、62.5%、58.33%、56.25%、54.16%、47.92%、35.42%、25%、22.92%、22.92%、8.33%。

3討論

沙門(mén)菌病是危害十分嚴(yán)重的人畜共患病，對(duì)人和動(dòng)物都有不同程度的致病力。2010年以來(lái)，全球每年約有100萬(wàn)沙門(mén)菌感染病例，且有繼續(xù)上升的趨勢(shì)[10]。在美國(guó)和歐盟一些國(guó)家，沙門(mén)菌引起的食源性疾病高居首位，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的公共安全，另一方面，沙門(mén)菌對(duì)畜牧業(yè)也造成了不可估量的損失，制約著畜牧業(yè)的發(fā)展。

表4 沙門(mén)菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果Table 4 Antibiotic sensitivity of Salmonella isolates

研究報(bào)道顯示沙門(mén)菌血清型約有2500種，中國(guó)約有290種血清型[11-12]。本研究采用增菌、選擇性培養(yǎng)基篩選、PCR鑒定的方法分析沙門(mén)菌在華東地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)的分布情況。結(jié)果表明，華東地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)中沙門(mén)菌的分離率高達(dá)16.84%；分離的菌株中，鼠傷寒沙門(mén)菌的流行是最為普遍的，約64.58%；腸炎沙門(mén)菌約6.25%；其他約29.17%；雞白痢沙門(mén)菌、雞傷寒沙門(mén)菌未分離到。查華等[13]2010～2012年分離到的沙門(mén)菌中，雞白痢沙門(mén)菌為優(yōu)勢(shì)菌，說(shuō)明華東地區(qū)流行的沙門(mén)菌血清型可能隨著時(shí)間發(fā)生了改變，并且不同地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)可能存在不同血清型沙門(mén)菌的流行。

目前已在不同血清型沙門(mén)菌中發(fā)現(xiàn)了23個(gè)毒力島[14]，分布在這些毒力島上的毒力基因與沙門(mén)菌的致病性密切相關(guān)。因此，檢測(cè)沙門(mén)菌的毒力基因分布，有助于分析沙門(mén)菌的致病力強(qiáng)弱。本研究選取沙門(mén)菌常見(jiàn)的毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示大部分毒力基因均在沙門(mén)菌中廣泛分布，提示沙門(mén)菌分離株毒力較強(qiáng)。另外，我們選取的7株臨床分離株LD50均在1.26×104～2.00×105CFU之間，發(fā)病及死亡速度快，對(duì)小鼠具有較強(qiáng)毒力。

近年來(lái)，越來(lái)越多的沙門(mén)菌已成為多重耐藥菌[15-18]。本研究采用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)臨床分離的沙門(mén)菌的耐藥性。結(jié)果表明，沙門(mén)菌分離株對(duì)多數(shù)抗生素耐藥，其中克林霉素、利福平的耐藥率高達(dá)100%，耐藥性十分嚴(yán)重，且各菌株均存在不同程度的多重耐藥，這與李郁[19]、李茂輝[20]、蹇慧[21]等的研究結(jié)果一致。因此，針對(duì)細(xì)菌病的防控和治療，必須合理地使用抗生素，否則，不僅難以控制細(xì)菌流行，反而極有可能導(dǎo)致超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，這將會(huì)對(duì)整個(gè)畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，乃至人類(lèi)食品的安全產(chǎn)生巨大威脅。