材料生物學(xué)
——骨修復(fù)材料的機遇與挑戰(zhàn)

王 靖，劉昌勝

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室超細材料制備與應(yīng)用教育部重點實驗室，上海200237)

1 前 言

近年來，疾病、自然災(zāi)害、交通事故等的頻發(fā)和人口老齡化的加劇導(dǎo)致臨床上骨組織損傷數(shù)量巨大[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國骨關(guān)節(jié)炎患者已達1.2億人，骨質(zhì)疏松患者達1億余人，骨創(chuàng)傷患者年達300萬人。我國骨修復(fù)材料的增長率高達20%，遠高于同期國際市場的9%。骨組織缺損與損傷已成為影響人們健康和生活的重要疾病，特別是對臨界尺寸的修復(fù)與重建仍是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)力求解決的難題。

對于大段骨缺損，僅僅依靠骨組織自身的修復(fù)能力無法愈合，必須進行骨移植手術(shù)，否則纖維組織將會填充缺損位置，阻礙新骨形成，造成骨不連。盡管自體骨移植存在骨來源有限、二次手術(shù)痛苦和取骨并發(fā)癥等問題，但目前仍是臨床治療的“金標(biāo)準(zhǔn)”。異體骨移植也因存在免疫排斥及潛在病源傳播的風(fēng)險，臨床應(yīng)用受到限制。采用功能化的人工材料進行修復(fù)，不僅可解決自體骨移植“以傷治傷”和來源有限的問題，還有效避免了異體骨移植所存在的諸多問題，成為目前臨床上自/異體骨移植之外治療骨缺損疾病的主要手段。因此，研究和開發(fā)滿足臨床需求的人工骨生物材料成為骨再生領(lǐng)域的重要課題。

目前，應(yīng)用于臨床的人工骨修復(fù)材料主要包括鈣磷基材料、生物玻璃以及膠原等產(chǎn)品。盡管這些材料在成分或結(jié)構(gòu)的某些方面模擬了天然骨組織，具有一定的引導(dǎo)組織生長和新骨沉積的作用。但與自體骨相比，上述材料仍然存在諸如生物活性不足、難以達到骨性愈合、血管化困難、材料降解速度與組織生長不匹配等瓶頸問題，加之人體創(chuàng)傷部位自身修復(fù)能力有限，尤其是對于臨界骨缺損患者和再生能力弱的群體，常常導(dǎo)致材料植入后缺損愈合速度慢，成骨量有限，臨床療效不盡人意[2]。這不僅導(dǎo)致醫(yī)療費用的增加，更加劇了患者的痛苦。

進一步分析，盡管骨修復(fù)材料是材料領(lǐng)域的研究熱點，但目前的研究大多集中在對材料表觀狀態(tài)的表征以及對最終成骨效果的評價，而對于材料植入體內(nèi)后如何參與骨修復(fù)的過程缺乏系統(tǒng)和精細的認識；另一方面，宿主微環(huán)境對植入材料的影響也不明了。這些認識上的盲區(qū)直接制約著新型材料的設(shè)計、構(gòu)建以及對骨組織再生過程的調(diào)控。而這些都涉及到材料在體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)。本文對材料植入體內(nèi)后與微環(huán)境相互作用并產(chǎn)生新的生物學(xué)效應(yīng)進行了簡要介紹，同時提出聚焦材料生物學(xué)研究，可能為構(gòu)建骨修復(fù)材料提供新思路。

2 體內(nèi)微環(huán)境

體內(nèi)微環(huán)境是指為組織生長提供營養(yǎng)和場所的環(huán)境，主要由基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)及各種細胞因子組成[3-5]。植入的生物材料正是在這一微環(huán)境中完成對骨損傷的修復(fù)。從細胞和分子水平來看，骨組織修復(fù)是一個復(fù)雜的過程，涉及材料、細胞、細胞外基質(zhì)與信號分子的識別、相關(guān)因子的表達及新骨的發(fā)育成熟等一系列鏈?zhǔn)竭^程[6]。材料植入后，也經(jīng)歷與正常骨折愈合相似的炎癥期、修復(fù)期和塑形期3個階段。但由于存在材料引起的宿主防御和材料參與的組織再生的交互作用，使得該過程更為復(fù)雜。例如，植入材料會選擇性地吸附蛋白并釋放離子以及生長因子等活性分子，形成新的微環(huán)境；體內(nèi)免疫細胞啟動免疫應(yīng)答機制，成骨相關(guān)細胞開始向材料表/界面聚集和粘附，進一步在微環(huán)境調(diào)控下增殖、分化成特定的成骨細胞系；隨后成骨細胞分泌特殊的蛋白，調(diào)控生物礦化，最終形成骨組織；同時伴隨著材料的降解、吸收和代謝，以及新骨的塑形?？梢姴牧蠌闹踩氲酵瓿晒切迯?fù)的全過程都與材料在體內(nèi)微環(huán)境中的生物學(xué)效應(yīng)密切相關(guān)。

當(dāng)材料植入后，材料本身的化學(xué)組成、表/界面和本體特征以及攜載的生長因子的種類、攜載方式等直接對微環(huán)境產(chǎn)生影響，繼而影響到組織形成。并且體內(nèi)微環(huán)境始終處于動態(tài)的變化中。相比之下，目前的材料學(xué)研究大多是在體外靜態(tài)環(huán)境中進行的，因而與體內(nèi)實際情況差別巨大。因此，構(gòu)建和優(yōu)化骨修復(fù)材料的前提和關(guān)鍵是深入認識和掌握材料與體內(nèi)微環(huán)境的相互作用，以及在這一動態(tài)微環(huán)境中材料的生物學(xué)效應(yīng)及其基本規(guī)律。劉昌勝近年來提出“材料生物學(xué)(Materiobiology)”這一新科概念[7]，即采用材料學(xué)的理論和方法研究生命現(xiàn)象、生命過程(圖1)。隨著更多的材料生物學(xué)新效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)，材料生物學(xué)對新型生物材料設(shè)計與制備的指導(dǎo)作用顯得越來越重要。

圖1 材料生物學(xué)將豐富和拓展材料基因組數(shù)據(jù)庫[7]Fig.1 Schematic representation of how the development of materiobiology enrich and deepen the contents of the Materials Genome Initiative(MGI)database[7]

3 炎性微環(huán)境及材料的免疫調(diào)控效應(yīng)

單核細胞與巨噬細胞是炎性反應(yīng)過程中兩種主要的免疫效應(yīng)細胞。巨噬細胞具有可塑性和多樣性，對環(huán)境中的信號分子能夠作出有效響應(yīng)，并改變其表型。材料植入到組織缺損部位后，首先發(fā)生的是微環(huán)境對體內(nèi)單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞的招募。這些免疫細胞一方面包圍和吞噬外來物質(zhì)，另一方面分泌各種細胞因子和生長因子，并進一步募集細胞參與組織再生與重建。對于骨修復(fù)材料與體內(nèi)免疫防御體系的認識，大多仍停留在如何避免植入材料引起炎癥反應(yīng)。但免疫反應(yīng)對于組織修復(fù)來說并非完全不利[8，9]。近年來更多的研究認為:材料植入后激發(fā)的機體的免疫應(yīng)答在材料參與骨組織再生方面起了關(guān)鍵作用。例如，研究發(fā)現(xiàn)，單核細胞在相關(guān)趨化因子作用下，從血液遷移至材料植入部位分化成巨噬細胞，并根據(jù)局部刺激因素不同，向M1型、M2型和調(diào)節(jié)性巨噬細胞極化，在炎癥反應(yīng)和后續(xù)免疫活動中起不同的作用。M1型細胞分泌促炎性細胞因子，促進組織的損傷，其長期活化對組織修復(fù)不利；M2型細胞主要釋放抗炎因子起到免疫調(diào)節(jié)作用，并釋放相關(guān)生長因子促進血管化和胞外基質(zhì)形成，利于組織修復(fù)和再生；巨噬細胞在材料及細胞因子的調(diào)控下，相互融合形成多核巨細胞，包裹于材料表面形成初始包裹體而促進組織修復(fù)。不同材料刺激下巨噬細胞所表達的趨化因子、表面標(biāo)記和代謝酶具有很大差異，從而在炎性和非炎性環(huán)境中表現(xiàn)出不同的功能?？梢娋奘杉毎臉O化方向?qū)τ诠墙M織修復(fù)重建的成敗起著重要作用。探明材料對巨噬細胞的極化方向及其信號通路的影響因素，在骨缺損修復(fù)的不同階段輔以適時引導(dǎo)，將更好地調(diào)控骨修復(fù)過程。此外，盡管宿主的炎癥反應(yīng)是組織對損傷和異物的正常應(yīng)答，但是炎癥的強度和持久性最終將影響材料在體內(nèi)的生物相容性、穩(wěn)定性和植入的有效性。設(shè)計具有適度免疫反應(yīng)的材料，通過激發(fā)適當(dāng)?shù)拿庖唔憫?yīng)，促進骨組織再生，這將是骨修復(fù)材料設(shè)計的新思路。同時，對骨修復(fù)材料的評價不僅需要考慮其對成骨相關(guān)細胞的作用，還應(yīng)考慮材料的免疫響應(yīng)及其產(chǎn)生的炎性環(huán)境對骨修復(fù)的影響。

免疫細胞在骨生成中起著不可或缺的調(diào)節(jié)作用，在骨再生過程中發(fā)揮積極作用。存在于骨組織中的巨噬細胞(OsteoMacs)是巨噬細胞中的特殊亞型，約占所有的骨髓細胞的六分之一[10]。炎性微環(huán)境被認為是影響細胞成骨分化的重要因素之一，可以影響成骨細胞的行為、凋亡、粘附和通透性。炎性因子種類眾多，并且其中許多因子之間能夠相互調(diào)節(jié)，表明免疫細胞在骨再生過程中具有雙重作用。充分了解免疫細胞是如何影響骨生成過程，將有助于開發(fā)免疫調(diào)節(jié)干預(yù)策略，促進骨修復(fù)。

從宿主的免疫系統(tǒng)來看，植入的生物材料也是一種異物，能夠引起自身系統(tǒng)多種的免疫反應(yīng)。生物材料不僅是簡單的免疫細胞的攻擊靶點，而且能夠顯著影響免疫反應(yīng)的程度和類型，材料的表面特性、粒徑大小、孔隙率和釋放的產(chǎn)物等都對免疫反應(yīng)有影響[11-14]。例如，表面粗糙度會影響由巨噬細胞分泌的炎性因子和趨化因子。相比光滑的鈦表面，粗糙的鈦表面有利于巨噬細胞的粘附和伸展。粗糙表面的植入物能夠促進傷口修復(fù)。材料表面調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的機理主要與蛋白的吸附行為有關(guān)，蛋白在吸附之后結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化使一些隱蔽的抗原暴露從而被免疫細胞識別，細胞通過特異受體結(jié)合而吸附于材料表面。

孔隙率和孔徑是支架材料的兩個關(guān)鍵參數(shù)，同樣也會影響巨噬細胞的免疫行為。小孔可能嚴重阻礙血液和組織液中營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的擴散，尤其是在植入材料的中心，會造成局部低氧環(huán)境，缺氧會增強局部炎癥，最終形成肉芽腫。有研究表明，隨著孔徑的增加，異物免疫反應(yīng)就會降低。增加纖維孔的大小能促進巨噬細胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)變。

生物材料植入體內(nèi)后通過物理化學(xué)溶解、熱解、酶解或腐蝕會出現(xiàn)不同程度的降解，在降解過程中釋放的離子會改變局部微環(huán)境，從而進一步影響免疫響應(yīng)[15]。例如，鈣是鈣磷基骨修復(fù)材料的主要成分之一，鈣離子通過非經(jīng)典通路Wnt/5A進行免疫調(diào)節(jié)。鎂是一種可降解的生物相容性金屬材料，鎂離子可以通過抑制Toll樣受體(TLR)通路進行免疫調(diào)節(jié)。鍶是一種已經(jīng)被用作治療骨質(zhì)疏松癥的微量元素，其可以通過阻斷NF-κB通路而抑制TNF-α的分泌。另外，Zn，Si，Co等生物活性離子也會引發(fā)系統(tǒng)不同的免疫響應(yīng)，因此可以通過控制生物材料中離子的釋放來操縱免疫反應(yīng)，這對骨修復(fù)材料的研發(fā)設(shè)計具有十分重要的意義。

以已獲臨床使用的磷酸鈣骨修復(fù)材料為例，Liu等研究發(fā)現(xiàn)[16]，摻入少量鎂離子后，磷酸鈣鎂支架(Magnesiumdoped calcium phosphate scaffold，MCPC)通過釋放鎂離子，調(diào)節(jié)了巨噬細胞RAW 264.7的炎性響應(yīng)，促進M2表達，并且M1表達下調(diào)。對成骨的影響方面，鎂離子的摻入降低了巨噬細胞炎性因子TNF-α、IL-6和IL-10的表達，并且誘導(dǎo)巨噬細胞高表達BMP-2和TGF-β1。在此基礎(chǔ)上，進一步研究了磷酸鈣鎂材料激發(fā)的巨噬細胞的免疫響應(yīng)，對骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨分化和內(nèi)皮細胞成血管能力的影響。在含有巨噬細胞條件培基的培養(yǎng)液中，MCPC對BMSCs的堿性磷酸酶(ALP)活性、礦化及成骨相關(guān)基因表達產(chǎn)生影響，其中磷酸鈣誘導(dǎo)的M1型免疫環(huán)境對BMSCs成骨無明顯作用，而磷酸鈣鎂所誘導(dǎo)的M2型免疫環(huán)境有利于成骨分化，這與RAW 264.7分泌的炎性因子密切相關(guān)。對細胞遷移實驗與芽體發(fā)生和血管化基因表達結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，磷酸鈣鎂對巨噬細胞的刺激能夠促進內(nèi)皮細胞HUVECs的血管化行為(圖2)。因此，磷酸鈣鎂能夠誘導(dǎo)RAW 264.7發(fā)生M2極化，這種轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的免疫微環(huán)境有利于骨修復(fù)。

4 成骨微環(huán)境與材料的因子協(xié)同效應(yīng)

圖2 磷酸鈣鎂支架(MCPC)的免疫調(diào)控效應(yīng)及其對成骨的影響[16]Fig.2 Schematic illustration of effects of MCPC on immunomodulation and the subsequent osteogenesis[16]

為了促進骨修復(fù)，提高植入材料的成骨活性，越來越多的研究者青睞于將骨誘導(dǎo)生長因子引入骨修復(fù)材料。其中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是一類具有誘導(dǎo)骨生成能力的生長因子，能使間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞。因其強大的成骨能力，BMP-2已經(jīng)被美國食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于臨床骨損傷治療[17]。

盡管BMP-2具有顯著療效，但其在實際使用當(dāng)中仍然存在諸多局限性。BMP-2體內(nèi)半衰期很短，植入體內(nèi)數(shù)小時后即可被蛋白酶分解。為獲得良好的融合效果，臨床上BMP-2的使用劑量都處于毫克級的超生理濃度范圍，不僅消耗了大量的醫(yī)療成本，而且易導(dǎo)致軟組織水腫、皮膚紅疹、局部炎癥反應(yīng)、異位骨化和免疫反應(yīng)等并發(fā)癥，直接影響患者的健康和生命安全。為了保持和提高BMP-2在體內(nèi)的生物活性，目前骨修復(fù)領(lǐng)域研究重點之一是尋找可能與BMP-2存在協(xié)同效應(yīng)的藥物或試劑，篩選BMP-2與藥物分子的最佳配伍，使BMP-2在其它生物分子的共同參與下，更好地誘導(dǎo)新骨形成。生物材料在維持生長因子活性、延長其半衰期方面作用顯著，通過載體材料的特性來緩慢釋放BMP-2，從而在局部達到有效的骨誘導(dǎo)作用[18-20]。

除了載體的保護作用外，以肝素為代表的磺化多糖還能增加 BMP-2本身的生物活性[21-23]。肝素能夠與BMP-2中的肝素結(jié)合域結(jié)合，劑量依賴性地增強BMP-2的同源二聚體和異源二聚體如BMP-2/6或BMP-2/7誘導(dǎo)的體外成骨分化；并且肝素存在下，BMP-2與其受體BMPR-IA、BMPR-II的結(jié)合增強。同時，肝素能夠通過降低BMP-2與其拮抗劑Noggin的結(jié)合，阻礙拮抗劑分子對BMP-2的降解和抑制作用，從而增強BMP-2所誘導(dǎo)的體內(nèi)外的成骨分化。Liu等進一步研究了多糖與BMP-2的相互作用，發(fā)現(xiàn)多糖需要與BMP-2發(fā)生親和，才能調(diào)節(jié)BMP-2的成骨活性?；腔嗵菍MP-2成骨活性的調(diào)節(jié)呈現(xiàn)“低促高抑”的規(guī)律，在最佳作用濃度下，磺化多糖通過上調(diào)BMSCs中內(nèi)源性受體BMPRs的表達，增強BMP-2-BMPRs間的識別，協(xié)同促進BMP-2誘導(dǎo)的成骨分化。在此基礎(chǔ)上，提出了生物材料的生長因子協(xié)同效應(yīng)[24](圖3)。生物材料不僅能通過緩控釋作用，保護生長因子，延長生長因子的作用時間，而且能通過對生長因子構(gòu)象、拮抗劑、受體結(jié)合等方面的影響，在不改變作用時間的條件下，增強生長因子的作用效率[25-26]。因此，設(shè)計特定的生物材料可以作為生長因子的增強劑，協(xié)同生長因子調(diào)控細胞的定向分化。

圖3 生物材料作為生長因子的增強分子[24]Fig.3 Biomaterials act as enhancer for growth factors via dual-mechanisms[24]

5 血管化微環(huán)境與材料的促血管再生效應(yīng)

血管形成主要通過血管發(fā)生和血管再生兩種途徑，創(chuàng)傷修復(fù)時新血管的再生以血管再生為主。組織修復(fù)再生以毛細血管網(wǎng)重建為開端，是一個由新的微血管發(fā)展成血流供應(yīng)系統(tǒng)的過程，其主要方式有出芽、套疊、鑲嵌體血管以及血管生成擬態(tài)等[27]。大尺寸骨組織缺損修復(fù)面臨的主要挑戰(zhàn)之一就是血管化三維結(jié)構(gòu)的建立，因為細胞只能通過血液彌散獲取200 μm之內(nèi)的氧和營養(yǎng)物質(zhì)。如果不能建立良好的血液循環(huán)，那么骨修復(fù)材料的最終尺寸將受到很大程度的限制。因此，如何提高骨修復(fù)材料的促血管化功能受到了關(guān)注。

一般情況下，血管生成受到多方面因素的調(diào)節(jié)，主要包括:促進血管再生的生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、纖維狀肌動蛋白、以及血管壁基質(zhì)的調(diào)節(jié)作用。由于血管化的重要性，理想的骨修復(fù)支架材料應(yīng)該具備促血管化的功能。目前，已有研究從材料表面和三維結(jié)構(gòu)等方面促進材料修復(fù)時的血管化。研究表明，生物惰性且表面相容性差的聚乙烯材料，不論其形狀大小、植入時間長短以及是否添加促進血管形成的生長因子，在血管長入方面都比羥基磷灰石差。材料表面涂層膠原或纖連蛋白后，血管內(nèi)皮細胞可以很好地粘附和增殖，并形成血管樣結(jié)構(gòu)。

支架材料適宜的三維孔隙結(jié)構(gòu)有利于營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣以及代謝產(chǎn)物的運輸和交換，并為新生血管的長入提供通道，因而有利于骨修復(fù)材料的血管化。對松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨再血管化的研究證實，松質(zhì)骨較皮質(zhì)骨血管形成更迅速和完全，這是因為松質(zhì)骨具有天然的三維多孔結(jié)構(gòu)，為血管長入提供了大量通道。借鑒松質(zhì)骨的高度連通結(jié)構(gòu)，利用3D打印技術(shù)可制備出高度連通中空結(jié)構(gòu)的支架，在臨界尺寸修復(fù)中發(fā)現(xiàn)有大量的連續(xù)血管生成，在動物實驗中發(fā)現(xiàn)骨修復(fù)效果更好[28]。

在材料組成方面，研究發(fā)現(xiàn)，在膠原材料中加入細胞外基質(zhì)成分氨基多糖可減少材料植入體內(nèi)時的異物反應(yīng)，改善細胞相容性和生物活性，并促進血管形成，其原因不僅是減少了不利于血管長入的異物反應(yīng)以及炎性細胞和纖維包膜的形成，也可能是由于氨基多糖本身能夠刺激血管的形成。另外，摻鍶聚硅酸鈣陶瓷的降解產(chǎn)物能明顯促進臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[29]。

Liu課題組發(fā)現(xiàn)了類肝素磺化殼聚糖促血管化作用。2-N，6-O-磺化殼聚糖(26SCS)通過調(diào)節(jié)促血管發(fā)生類細胞因子、促內(nèi)皮細胞有絲分裂和增殖類細胞因子及炎癥類細胞因子這3類細胞因子的分泌，從而直接或間接地影響血管生成。此外，26SCS存在下，HUVECs的增殖、芽體發(fā)生、血管化相關(guān)基因表達和細胞因子分泌都增強?；诨腔瘹ぞ厶堑拇傺芑?yīng)設(shè)計骨修復(fù)材料，在兔橈骨大段骨缺損的動物實驗中，能夠有效促進缺損部位血管網(wǎng)絡(luò)的修復(fù)[30]，促進骨修復(fù)，提高修復(fù)質(zhì)量(圖4)。

圖4 含磺化多糖材料對骨修復(fù)的影響[30]Fig.4 Schematic diagram of the effect of sulfated chitosan-contained biomaterials on the bone repairing[30]

6 結(jié) 語

已有研究表明，植入材料在體內(nèi)微環(huán)境中表現(xiàn)出免疫調(diào)控效應(yīng)、與生長因子的協(xié)同效應(yīng)、促血管化效應(yīng)等新的生物學(xué)效應(yīng)。但由于目前對材料的生物學(xué)功能的研究大多停留在單一因素分析，缺乏對材料生物學(xué)效應(yīng)的系統(tǒng)研究，因此導(dǎo)致材料的潛在的生物學(xué)效應(yīng)還未發(fā)現(xiàn)，而這些生物學(xué)效應(yīng)恰恰是在體內(nèi)復(fù)雜的動態(tài)微環(huán)境、多細胞體系的作用中表現(xiàn)出來的。因此，有必要聚焦涉及生命現(xiàn)象和生命過程的生物材料及其生物學(xué)效應(yīng)，揭示材料在生命活動中的作用規(guī)律，在細胞、組織/器官及整個生物體等不同層面探索材料特征對其生物學(xué)功能的影響及其調(diào)控規(guī)律，研究材料特性與生物功能的關(guān)聯(lián)性，建立生物材料基因組數(shù)據(jù)庫，為新型材料的設(shè)計和新功能挖掘提供理論支持。