海水暫養(yǎng)過程中縊蟶揮發(fā)性成分變化

冉 云，張思嘉，陳 蓉，冉照收，徐繼林*，廖 凱

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

縊蟶（Sinonovacula constricta）是我國重要的經(jīng)濟(jì)貝類，有著悠久的養(yǎng)殖和食用歷史，味道鮮美，蛋白質(zhì)和鈣、鐵、鋅、硒等含量豐富[1]，已成為東南沿海的主要海水貝類養(yǎng)殖品種。貝類凈化是指將濾食性的雙殼貝類放置在干凈的水環(huán)境中去除泥沙、細(xì)菌和致病微生物的過程，縊蟶作為灘涂貝類的典型代表，其習(xí)性為底棲洞穴生活，捕撈后的縊蟶需要通過暫養(yǎng)凈化。貝類凈化的方法主要有凈水區(qū)暫養(yǎng)和工廠凈化2種方式，其中工廠凈化過程中常用的海水消毒殺菌系統(tǒng)有紫外線、氧和臭氧，但暫養(yǎng)是目前消除化學(xué)物質(zhì)污染的唯一方法?，F(xiàn)在已有較多暫養(yǎng)凈化方式的研究，比如在暫養(yǎng)水體中添加二氧化氯或微藻活體等[2-3]，實(shí)際生活中一般家庭大多直接放在海水中暫養(yǎng)，而有關(guān)暫養(yǎng)時間對縊蟶風(fēng)味的研究還很少見。本實(shí)驗(yàn)通過固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析在普通海水中暫養(yǎng)凈化后的縊蟶不同部位風(fēng)味物質(zhì)隨時間的變化情況，以期為縊蟶的合理凈化時間選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新捕撈的帶泥縊蟶購于寧波市路林市場，挑選長（7.11±0.18）cm、寬（2.37±0.05）cm的縊蟶，置于溫度26 ℃、鹽度25%的海水中，避光暫養(yǎng)8、24 h后聯(lián)同未暫養(yǎng)的縊蟶，分別取18 只樣品按照暫養(yǎng)時間在取樣后及時用于風(fēng)味物質(zhì)測定，暫養(yǎng)期間不換水。

2,4,6-三甲基吡啶（2,4,6-trimethylpyridine，TMP）、C7～C40正構(gòu)烷烴混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-7000C氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀美國安捷倫儀器公司；頂空固相微萃取自動進(jìn)樣裝置德國Gerstel公司；VOCOL色譜柱（60 m×0.32 mm，0.18 μm）、50/30 μm二乙烯苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）自動固相微萃取頭 美國Supelco公司；T10勻漿機(jī) 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

把縊蟶泥垢洗凈后在自然狀態(tài)下用吸水紙除去表面水分，將樣品分為3 組，分別為消化腺、肌肉及整體，每組3 個平行，添加內(nèi)標(biāo)后用勻漿機(jī)將各組分別混合均勻，備用。

1.3.2 頂空固相微萃取條件

取4 g處理好的樣品放入20 mL頂空瓶中，旋緊蓋，通過頂空固相微萃取自動進(jìn)樣裝置，用老化好的DVB/CAR/PDMS萃取頭于80 ℃萃取30 min后，在250 ℃解吸7 min后進(jìn)樣分析。

1.3.3 氣相色譜條件

VOCOL色譜柱（60 m×0.32 mm， 0.18 μm）；升溫程序：柱起始溫度35 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min升至125 ℃，保持1 min，再以2 ℃/min升至200 ℃，保持12 min；載氣（He）流速1.6 mL/min；采用不分流進(jìn)樣模式。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度220 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～500；溶劑延遲時間2 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

定性方法：將測得的各揮發(fā)物譜圖與計(jì)算機(jī)譜庫（NIST/Wiley）中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖進(jìn)行對比，輔助以人工圖譜解析，并結(jié)合正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間進(jìn)行定性分析。

半定量方法[4]：將內(nèi)標(biāo)物TMP用甲醇稀釋后添加到處理好的縊蟶樣品中，用量為1 g樣品加入0.03 μg TMP。然后通過色譜圖中待測物與TMP的峰面積比值計(jì)算其含量。

數(shù)據(jù)處理及多元統(tǒng)計(jì)分析方法：采用SIMCA軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial least squaresdiscrimination analysis，PLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 風(fēng)味物質(zhì)分析

如表1所示，縊蟶中共鑒定出128 種揮發(fā)性風(fēng)味成分。其中包括醛類（33 種）、酮類（12 種）、醇類（10 種）、芳香類（17 種）、烴類（16 種）、酯類（22 種）、呋喃類（5 種）以及其他化合物（13 種）。

2.2 縊蟶不同組織揮發(fā)性組成總體差異性分析

圖1 縊蟶不同部位揮發(fā)性化合物PCA得分圖Fig. 1 PCA score plot for volatile components in different parts of S. constricta

表1 縊蟶不同組分的揮發(fā)性成分Table 1 Volatile compounds in different edible parts of S. constricta

續(xù)表1

為考察不同組織揮發(fā)性組成之間的總體差異性，根據(jù)各樣品揮發(fā)性組成進(jìn)行PCA，由圖1可知，95%的置信區(qū)域內(nèi)，縊蟶樣品得到明顯區(qū)分。從不同部位上來看，縊蟶肌肉集中在PC1的負(fù)方向，縊蟶消化腺集中在第1象限，縊蟶整體集中于第4象限，說明縊蟶不同部位的揮發(fā)性成分總體存在明顯差異。從同一組織不同暫養(yǎng)時間來看，不同時間組的縊蟶肌肉樣本聚集緊密，說明在24 h暫養(yǎng)時間內(nèi)，縊蟶肌肉揮發(fā)性成分無明顯改變；而不同時間組的縊蟶整體樣本和縊蟶消化腺樣本均有明顯差異，說明在暫養(yǎng)過程中，縊蟶整體和消化腺揮發(fā)性成分有較顯著變化。縊蟶整體樣品（F0、F8、F24）隨著暫養(yǎng)時間的延長，由第4象限逐漸向原點(diǎn)靠近，并與縊蟶肌肉（M0、M8、M24）所在區(qū)域的距離逐漸縮短；而縊蟶消化腺（S0、S8、S24）中，暫養(yǎng)8 h（S8）與24 h樣品（S24）相較于0 h對照組（S0），同樣有向縊蟶肌肉所在區(qū)域靠近的趨勢。

2.3 暫養(yǎng)時間對不同組織揮發(fā)性組成的影響

為更好地解釋圖1中各樣品的變化趨勢，同時更直觀地說明縊蟶各部分隨暫養(yǎng)時間的風(fēng)味變化情況，首先對樣本中包含的揮發(fā)性物質(zhì)按官能團(tuán)進(jìn)行分類，并通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]確定具有特征性氣味的揮發(fā)性組分并編號（表1），建立X數(shù)據(jù)集（特征揮發(fā)性組分）與Y數(shù)據(jù)集（不同暫養(yǎng)時間下的樣本點(diǎn)），對消化腺樣品和整體樣品分別進(jìn)行PLS-DA，并采用雙標(biāo)圖呈現(xiàn)。

2.3.1 縊蟶整體風(fēng)味特點(diǎn)分析

圖2 縊蟶整體揮發(fā)性成分PLS-DA雙標(biāo)圖Fig. 2 PLS-DA biplot for volatile components in S. constricta

如圖2所示，絕大多數(shù)揮發(fā)性成分分布于相關(guān)性為100%和75%的橢圓之間，僅有含氮化合物N5、N7和酯類Z12、Z13位于50%的橢圓內(nèi)，說明該模型可以較好地解釋X、Y數(shù)據(jù)集的相關(guān)性關(guān)系。此外不同暫養(yǎng)時間的樣本點(diǎn)均遠(yuǎn)離坐標(biāo)原點(diǎn)，且相距較遠(yuǎn)，證明不同暫養(yǎng)時間的揮發(fā)性成分差異大。

由表1可知，造成縊蟶魚腥味、泥土味、糞臭味等不良風(fēng)味的物質(zhì)主要為直鏈飽和醛（Q1、Q7、Q22、Q24、Q25）、苯酚類（B2、B3）、含氮化合物（N7）。直鏈飽和醛類具有閾值低、刺激性大的特點(diǎn)，其中己醛、癸醛、壬醛、辛醛等會產(chǎn)生刺鼻、油脂氧化等令人不愉快的味道[8]。有研究表明[9]，十一烷醛、癸醛、壬醛、辛醛分別來自于8-，9-，10-，11-氫過氧化異構(gòu)體的分解，而戊醛、己醛、2-庚醛、2-壬烯醛是由于亞油酸的自動氧化。這些物質(zhì)大都分布于圖2中的右下角且臨近邊界，對于縊蟶整體風(fēng)味影響很大。而未經(jīng)暫養(yǎng)的對照組（F0）分布于第4象限，與這些不良風(fēng)味物質(zhì)有較強(qiáng)的相關(guān)性，說明未經(jīng)暫養(yǎng)的縊蟶具有較為強(qiáng)烈的土腥味。在對照組（F0）附近聚集著許多短鏈脂肪酸甲酯，如辛酸甲酯、壬酸甲酯、癸酸甲酯等，這些酯類具有愉悅的花香、水果、甜味、青味，但由于這些物質(zhì)的閾值相對較高，因此對整體氣味的貢獻(xiàn)較低。文獻(xiàn)[10-11]所報(bào)道的縊蟶風(fēng)味物質(zhì)中酯類的種類和含量都很少，而本實(shí)驗(yàn)所檢出的酯類物質(zhì)含量較多，這可能與縊蟶種類及檢測方式更為靈敏有關(guān)。此外，一些不飽和醇也與F0組距離較近，而這些物質(zhì)是新鮮水產(chǎn)品清香味的主要來源[12]。飽和醇類的閾值較高，因此被認(rèn)為對水產(chǎn)品風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)不大，但C8、C9等不飽和醇，賦予水產(chǎn)品青草味、黃瓜味、西瓜味、蘑菇味等特殊風(fēng)味[13]，本研究中含量較高的1-辛烯-3-醇（蘑菇香、蔬菜香）是一種重要的氣味物質(zhì)，在真菌蘑菇中最為常見，是構(gòu)成蘑菇香氣含量最高的化合物[14]；但也有研究表明1-辛烯-3-醇與吲哚共同作用，可能會產(chǎn)生金屬味、土腥味等不愉快味道[15]，而且它還是構(gòu)成魚腥味的重要化合物[16]，1-辛烯-3-醇產(chǎn)生的原因可能是脂肪氧化酶對亞油酸的氧化分解，催化含有順1,3-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸，生成氫過氧化物，再經(jīng)過氧化物裂解酶生成1-辛烯-3-醇等物質(zhì)[17]。因此未經(jīng)暫養(yǎng)處理的縊蟶風(fēng)味較為復(fù)雜且濃烈，主要以腥味、青味為主，同時也具有花香、水果香。

暫養(yǎng)8 h縊蟶整體（F8）附近風(fēng)味成分少，但與具有青味、草味、脂肪香氣、植物味的不飽和醛（Q4、Q6、Q11、Q16）共同位于PC2的負(fù)半軸，目前相關(guān)研究可以證明：不飽和醛通常來源于亞油酸等多不飽和脂肪酸的降解[18-19]。低于C10的不飽和醛和醇，是新鮮貝肉的重要?dú)馕段镔|(zhì)[20]，其中一些分子質(zhì)量低的醛類化合物，尤其是烯醛、二烯醛對特征風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，本研究所測得的此類物質(zhì)主要有2-辛烯醛、反-2-辛烯醛、2-壬烯醛、2,4-庚二烯醛等，有青香及脂肪的氣息。這說明暫養(yǎng)8 h縊蟶風(fēng)味強(qiáng)度與對照組（F0）相比明顯減弱，更加柔和，其特質(zhì)性氣味為黃瓜味、青味、清新植物味。

暫養(yǎng)24 h縊蟶整體（F24）位于Y軸正方向，與具有特征性氣味的揮發(fā)性成分集中區(qū)域方向相反，證明暫養(yǎng)24 h縊蟶整體揮發(fā)性成分改變明顯，已經(jīng)明顯失去水產(chǎn)品縊蟶最初的原有風(fēng)味特征。雖然這些樣本點(diǎn)周圍零星分布有丙酸甲酯、3-苯甲酸甲酯、2-癸酮等具有花果氣味特征的風(fēng)味成分，但由于這些物質(zhì)閾值過高，對于縊蟶特征性風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)程度有限，無法逆轉(zhuǎn)由于不飽和醛、酮含量降低所造成的風(fēng)味損失。此外，在F24樣本點(diǎn)附近，還分布有一些不良風(fēng)味因子如庚酸（酸臭、汗臭、霉臭）、對甲苯酚（動物味）[21]，使得縊蟶整體的感官品質(zhì)下降。

2.3.2 縊蟶消化腺風(fēng)味特點(diǎn)分析

圖3 縊蟶消化腺揮發(fā)性成分PLS-DA雙標(biāo)圖Fig. 3 PLS-DA biplot for volatile components in the digestive gland of S. constricta

由圖3可知，揮發(fā)性組分在雙標(biāo)圖中分布較為松散，絕大多數(shù)揮發(fā)性成分分布于相關(guān)性為75%和50%的橢圓之間。其中未處理（S0）組位于第4象限，與其相距較近的特征性風(fēng)味物質(zhì)主要為具有新鮮、青味、脂肪味、花瓣、堅(jiān)果的醛類，以及甜香、花香、酒香的酯類，如苯甲醛、2,4-辛二烯醛、戊醛、2-壬酮等。其中苯甲醛具有獨(dú)特的杏仁味芳香味，是海產(chǎn)品中普遍存在的風(fēng)味物質(zhì)，有研究認(rèn)為，它可能是形成雜環(huán)化合物的重要中間體，有助于提高整體風(fēng)味質(zhì)量[22]；而2,4-辛二烯醛、戊醛、癸醛是縊蟶和牡 蠣等的優(yōu)良餌料骨條藻、威氏海鏈藻的特征性揮發(fā)性物質(zhì)，在魚蝦貝等海產(chǎn)品特征性風(fēng)味的形成中起到重要作用[23]。但也有諸多研究指出，當(dāng)這些烯醛含量過高時會使水產(chǎn)品呈現(xiàn)出較重的腥味與哈喇味，如戊醛是許多海產(chǎn)品的重要腥味來源；此外酮類物質(zhì)也是水產(chǎn)品風(fēng)味的重要來源，有研究表明2-壬酮、2-庚酮是雪蟹中的主要酮類物質(zhì)，且經(jīng)過加熱煮制后含量明顯增加[24]，2-壬酮具有青味、泥土味、草腥味，在魚腥草中含量較高，賦予魚腥草特殊的腥味[25-26]。目前認(rèn)為酮類化合物可能產(chǎn)生的方式有多不飽和脂肪酸的熱氧化降解、氨基酸的降解以及微生物的氧化等，也可能是由碳鏈發(fā)生β氧化后再經(jīng)脫羧形成的[27]。由以上分析可知，對照組縊蟶消化腺含量較高、影響較大的風(fēng)味成分常見于微藻餌料、植物中小分子代謝產(chǎn)物，這可能是由于未經(jīng)暫養(yǎng)處理的縊蟶消化腺內(nèi)含有較多食物殘?jiān)@些食物殘?jiān)?jīng)過微生物的發(fā)酵分解，產(chǎn)生小分子的揮發(fā)性物質(zhì)，這些物質(zhì)既是海產(chǎn)品清香味的重要來源，但同時也會造成樣品的海腥、草腥味。

暫養(yǎng)8 h組（S8）位于第1、2象限，與風(fēng)味成分集中的Y軸負(fù)半軸方向相反，說明S8組與S24及S0組氣味差異較大，且強(qiáng)度更低。與S8組距離較近的風(fēng)味成分主要為低級酯類如3-苯丙酸甲酯、癸酸甲酯、壬酸甲酯、丙酸甲酯等，這些低級脂肪酸甲酯常見于水果、鮮花中，具有柑橘香、花香、蜜瓜香等香氣特征。此外2-戊基呋喃在該組含量較高，具有豆香、果香、泥土香味，且閾值較低，僅為6 μg/kg[28]，因此它在呋喃類物質(zhì)中是縊蟶風(fēng)味的主體成分。丙醛、2-十一醛為S8組特征性醛類，賦予樣本清香和水果香氣。

暫養(yǎng)24 h縊蟶（S24）與未處理組（S0）均位于Y軸負(fù)方向，因此S24組的風(fēng)味特征與未處理組S0類似。在該區(qū)域中影響較大的風(fēng)味化合物為C6～C10的醛類，這些醛類具有青味、土味、腥味等風(fēng)味特征，如庚醛、E-2-壬烯醛、二甲基硫醚是海洋味、干魚味、土腥味的重要來源，而己醛、壬醛、2,6-壬二烯醛等具有強(qiáng)烈的青草、蔬菜味。S0組的揮發(fā)性物質(zhì)可能來自于消化腺殘留的微藻餌料以及養(yǎng)殖水體中的嗅味物質(zhì)，尤其是二甲基硫醚在該組含量最高，它是海產(chǎn)品腥味的來源之一，低濃度時表現(xiàn)為青草味、海水味、玉米味[12]，海洋中的二甲基硫主要存在于微藻細(xì)胞中，一些貝類、魚類可通過攝食直接在體內(nèi)積累，同時也有可能通過組織結(jié)構(gòu)中含硫物質(zhì)的降解，產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物。生物體內(nèi)含硫化合物主要有以下3 種存在形式：含硫氨基酸如甲硫氨酸、半胱氨酸；含硫維生素如VB1；含硫多肽如谷胱氨肽等。這些物質(zhì)經(jīng)過微生物酶的催化作用，降解生成二甲基硫醚、三甲胺等[29]。而S24組的揮發(fā)性物質(zhì)可能來自于胃腸道內(nèi)微生物的分解代謝產(chǎn)物，一些有可能為主要揮發(fā)性成分如醛類等也可能是由于受這些微生物的生長繁殖和代謝活動的影響，因而并未呈現(xiàn)出整體中揮發(fā)性成分含量介于消化腺和肌肉之間的這種結(jié)果。但當(dāng)進(jìn)行短時間暫養(yǎng)時，縊蟶通過濾水、排泄等生理活動，將食物殘?jiān)?、泥沙排出體外，此時微生物總量少，分解有機(jī)物的能力較弱，因此S8組中揮發(fā)性成分呈下降趨勢，土腥味強(qiáng)度最弱。

2.3.3 縊蟶肌肉風(fēng)味特點(diǎn)分析

由圖4可以看出，揮發(fā)性成分大多集中在50%的橢圓內(nèi)，并以原點(diǎn)為中心呈輻射狀分布，僅有少部分的成分因子集中于X軸正半軸區(qū)域，與未處理組M0距離較近。這說明縊蟶肌肉的各種風(fēng)味較為平衡，且強(qiáng)度較低。此外各樣本點(diǎn)距離較近，大多分布于原點(diǎn)周圍，說明不同時間點(diǎn)樣品的揮發(fā)性組成差異較小，與PCA得分圖相一致（圖1），符合縊蟶肌肉氣味清香、滋味柔和的風(fēng)味特點(diǎn)，同時反映出暫養(yǎng)對縊蟶肌肉的風(fēng)味改變作用不明顯。

圖4 縊蟶肌肉揮發(fā)性成分PLS-DA雙標(biāo)圖Fig. 4 PLS-DA biplot for volatile components in meat of S. constricta

3 討 論

貝類消化腺中殘留有泥沙微藻、浮游生物殘?jiān)约芭判刮?，會造成腥味及沙粒感等不良感官體驗(yàn)，因此從采捕到上市流通前通常需要暫養(yǎng)凈化，使得富集于貝類消化腺中的菌落總數(shù)下降、食物殘?jiān)约澳嗌撑懦?，可以提高貝類的感官品質(zhì)。而暫養(yǎng)水體及暫養(yǎng)時間是決定暫養(yǎng)效率和效果的重要參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)主要研究暫養(yǎng)時間這一參數(shù)對縊蟶揮發(fā)性成分的影響。

從縊蟶整體來看，暫養(yǎng)8 h（F8）與未處理組F0組揮發(fā)性成分組成相似，但F8組與風(fēng)味因子集中區(qū)域具有一定距離，說明暫養(yǎng)8 h的縊蟶整體在保留原有獨(dú)特風(fēng)味的同時，由于不良?xì)馕稄?qiáng)度下降使得縊蟶更加適口。從縊蟶消化腺來看，新捕撈的縊蟶消化腺含有大量未排出的糞便和食物殘?jiān)?、泥沙以及富集于腸道內(nèi)的致嗅物，通常被認(rèn)為是縊蟶不良口感水草味和土腥味的主要來源，通過短時間暫養(yǎng)縊蟶的揮發(fā)性組分含量下降明顯（表1），但當(dāng)暫養(yǎng)時間過長時，許多成分的含量又呈現(xiàn)回升趨勢。因此為盡可能消除縊蟶消化腺對于整體風(fēng)味的影響，暫養(yǎng)8 h效果要優(yōu)于24 h。從縊蟶肌肉來看，暫養(yǎng)對于其風(fēng)味改變不大，由此可以推斷縊蟶整體的風(fēng)味變化主要是由于消化腺中揮發(fā)性成分的變化，短時間的暫養(yǎng)可以使胃容物及泥沙排空；但當(dāng)暫養(yǎng)時間過長，縊蟶特征性風(fēng)味逐漸消失，同時消化腺中微生物的代謝活動以及縊蟶自身脂肪酸、氨基酸的降解均可導(dǎo)致不良風(fēng)味成分增加?？梢? h是最佳的暫養(yǎng)時間，即可使縊蟶在保留其清香、海洋味、甘甜等風(fēng)味特點(diǎn)，又能較大程度地降低腥味、泥土味等不良?xì)馕叮泄倨焚|(zhì)得到提升。