王麗 陳洪軒 常杰等

摘要 [目的]研究替米考星淀粉微球的制備工藝。[方法]以可溶性淀粉為原料，以N，N-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，以過硫酸鉀和亞硫酸氫鈉為引發(fā)劑，采用包埋法制備替米考星淀粉微球。以載藥量和包封率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)，采用綜合平衡法對替米考星淀粉微球的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，在掃描電子顯微鏡下觀察替米考星交聯(lián)微球的形貌及表面形態(tài)。[結(jié)果]替米考星淀粉微球的最佳制備工藝如下：替米考星0.02 g，可溶性淀粉4 g，交聯(lián)劑（N，N-亞甲基雙丙烯酰胺）0.95 g，乳化劑（mSpan80：mTween80=2∶1）0.75 g，反應(yīng)時(shí)間1.5 h，在優(yōu)化工藝參數(shù)下制得的替米考星淀粉微球載藥量為1.63%，包封率為81.4%;微球大小分布均勻，外觀圓整，表面粗糙多孔。[結(jié)論]該制備工藝可行，擴(kuò)大了替米考星的應(yīng)用，為替米考星的劑型改進(jìn)提供了參考。

關(guān)鍵詞 替米考星;可溶性淀粉;包埋法;微球制備工藝

中圖分類號(hào) S859.79+6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）04-0110-04

Abstract [Objective] To study the preparation process of tilmicosin starch microspheres.[Method] With soluble starch as materials，N，Nmethylenebisacrylamide as crosslinking agent and potassium persulfate with sodiun bisulflte as initiator，tilmicosin starch microsphere was synthesized by using embedding method.The preparation process of tilmicosin starch microsphere was optimized by integrated balance method through the orthogonal experiment，with the drug loading and encapsulation rate as indicators.The morphology features and surface topography of tilmicosin starch microsphere were characterized by Quanta 250FEG scanning electron microscope.[Result]The optimum preparation process was as follows：the quantity of tilmicosin 0.02 g，soluble starch 4.0 g，N，Nmethylenebisacrylamide 0.95 g，surfactant （mSpan80∶mTween80=2∶1）0.75 g， and the reaction time was 1.5 h.Under these optimized technology parameters，the drug loading and embedding ratio of tilmicosin starch microsphere were ?1.63% and 81.4% respectively.The size of microspheres was uniform，the appearance was round and the surface was rough and porous.[Conclusion] The ?preparation process was feasible，which expanded the application of tilmicosin.Therefore this research provided references for the improvement of tilmicosins dosage forms .

Key words Tilmicosin;Soluble starch; Embedding method;Preparation process of microspheres

替米考星是一種以泰樂菌素為前體藥物半合成而來的畜禽專用抗生素[1]，20世紀(jì)80年代由英國Elanco公司開發(fā)。替米考星具有很強(qiáng)的抗菌活性，抗菌譜廣，耐藥性低，對所有的革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌、霉形體、螺旋體等均有抑制作用，臨床上主要用于預(yù)防和治療豬、雞、牛、羊等由細(xì)菌和支原體感染引起的疾病，如豬喘氣病、乳房炎、雞慢性呼吸道病、胸膜炎等[2]。目前，替米考星已在許多國家批準(zhǔn)上市，我國現(xiàn)有劑型主要有預(yù)混劑、注射液、飲水劑，但現(xiàn)有劑型給藥后會(huì)表現(xiàn)出明顯的峰谷現(xiàn)象，且產(chǎn)生心臟毒性和腎臟毒性的可能性較大，使不良反應(yīng)率大大增加[3-4]。微球具有緩釋與長效性、掩蓋藥物不良?xì)馕?、提高藥物穩(wěn)定性、低毒、無免疫原性等特點(diǎn)[5-6]。以無毒、安全、原料廉價(jià)易得的可溶性淀粉為原料制備的微球是一種理想的新型藥物載體，具有較好的生物可降解性、生物相容性、生物穩(wěn)定性和較低的毒性[7-8]。筆者以可溶性淀粉為原料，采用包埋法[9]制備替米考星淀粉微球，并對其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳制備工藝，擴(kuò)大其臨床應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 試劑和藥物 替米考星（遼寧大連鑫輝生物科技有限公司，批號(hào)為20140402）、可溶性淀粉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20160922）、環(huán)己烷（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20140308）、司班80（上?；瘜W(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20140812）、吐溫80（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)為20120720）、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20171012）、無水乙醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20160801）、乙酸乙酯（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20161001）、過硫酸鉀（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20150710）、亞硫酸氫鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20161210）、氫氧化鈉（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20081018）。試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器 紫外分光光度計(jì)（TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、場發(fā)射掃描電鏡（Quanta 250FEG，美國FEI）、集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鄭州長盛實(shí)驗(yàn)設(shè)備器有限公司）、循環(huán)水式多用真空泵（SHB-ⅢA，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、超聲波清洗器（KQ2200E，昆山市超聲儀器有限公司）、電子天平（WT5003CH，常州萬泰天平儀器有限公司）。

1.3 淀粉微球的制備

1.3.1 空白淀粉微球的制備。

1.3.1.1 油相的制備。將80 mL環(huán)己烷置于250 mL錐形瓶中，加入司班80和吐溫80（按質(zhì)量比2∶1加入），在50 ℃水浴條件下，攪拌溶解，備用。

1.3.1.2 水相的制備。將4 g可溶性淀粉置于100 mL燒杯中，加入30 mL純化水，在80 ℃水浴條件下，使其溶解;用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 9～10;轉(zhuǎn)移至60 ℃恒溫水浴鍋中，加入0.6 g N，N-亞甲基雙丙烯酰胺和0.6 g過硫酸鉀，攪拌溶解，備用。

1.3.1.3 空白微球的制備。將油相加入到水相中，置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，50 ℃下攪拌使其乳化0.5 h，加入0.6 g亞硫酸氫鈉，升溫至60 ℃，引發(fā)交聯(lián)反應(yīng)，攪拌反應(yīng)2 h，靜置，取下層沉淀，用適量乙酸乙酯洗滌多次，再用適量無水乙醇洗滌多次，抽濾，干燥，得到空白淀粉微球。

1.3.2 替米考星淀粉微球的制備。使用以下成分制備替米考量淀粉微球：替米考星0.02 g、環(huán)己烷80 mL、 司班80∶吐溫80（質(zhì)量比為2∶1）0.75 g、可溶性淀粉4 g、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺0.95 g、過硫酸鉀0.6 g、亞硫酸氫鈉0.6 g、蒸餾水30 mL。

1.3.2.1 油相的制備。將80 mL環(huán)己烷置于250 mL錐形瓶中，加入司班80和吐溫80（按質(zhì)量比2∶1加入），在50 ℃水浴條件下，攪拌溶解，待用。

1.3.2.2 水相的制備。將4 g可溶性淀粉置于100 mL燒杯中，加入30 mL純化水，在80 ℃水浴條件下，使其溶解;降溫至60 ?℃，加入0.02 g替米考星、0.95 g N，N-亞甲基雙丙烯酰胺和0.6 g過硫酸鉀，攪拌溶解，備用。

1.3.2.3 替米考星淀粉微球的制備。將油相加入到水相中，置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，50 ℃下攪拌使其乳化0.5 h，加入0.6 g亞硫酸氫鈉，升溫至60 ℃，引發(fā)交聯(lián)反應(yīng)，攪拌反應(yīng)2 h，靜置后取下層沉淀，用適量乙酸乙酯洗滌多次，再用適量無水乙醇洗滌多次，抽濾并干燥，得到替米考星淀粉微球。

1.4 替米考星標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取替米考星0.011 3 g置于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇定容，為儲(chǔ)備液。分別從上述儲(chǔ)備液中一起移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻。在紫外可見分光光度計(jì)下于最大吸收波長282 nm[10]處測定吸光度，繪制替米考星的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 單因素試驗(yàn)

為了考察影響替米考星淀粉微球的載藥量和包封率的因素，根據(jù)替米考星淀粉微球的制備方法，控制其他因素和條件不變，分別以替米考星的用量、反應(yīng)時(shí)間、交聯(lián)劑的用量、乳化劑的用量為研究對象進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.6 正交試驗(yàn)

為了確定替米考星淀粉微球的最佳制備工藝，在單因素試驗(yàn)結(jié)果及有關(guān)報(bào)道的基礎(chǔ)上[11]，選定替米考星用量（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、交聯(lián)劑用量（C）、乳化劑用量（D）為影響因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平（表1），進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.7 評價(jià)指標(biāo)

每次取0.1 g替米考星淀粉微球，加入定量的無水乙醇，超聲一定時(shí)間，過濾后取濾液，用無水乙醇定容至50 mL，在紫外分光光度計(jì)下測其吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算替米考星濃度，最后計(jì)算其載藥量（Y1）和包封率（Y2）。

1.8 替米考星交聯(lián)淀粉微球的表征

取一定量的替米考星淀粉微球真空冷凍干燥后噴金制樣，在Quanta 250FEG掃描電子顯微鏡下觀察其形貌及表面形態(tài)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 替米考星的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，替米考星的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.036 2x+0.000 2（R2=0.999 9），在濃度0.005～0.050 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 替米考星用量對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響。按照“1.3”的試驗(yàn)方法，控制處方及制備工藝中其他條件不變，分別考察替米考星用量為0.02、0.05、0.10和0.15 g 時(shí)對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響，結(jié)果見圖2。

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響。按照“1.3”中試驗(yàn)方法，控制處方及制備工藝中其他條件不變，分別考察反應(yīng)時(shí)間為1.0、1.5、2.0、2.5 h時(shí)對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響，結(jié)果見圖3。

2.2.3 交聯(lián)劑用量對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響。按照“1.3”中試驗(yàn)方法，控制處方及制備工藝中其他條件不變，分別考察交聯(lián)劑用量為0.85、0.90、0.95、1.00 g時(shí)對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響，結(jié)果見圖4。

2.2.4 乳化劑用量對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響。按照“1.3”中試驗(yàn)方法，控制處方及制備工藝中其他條件不變，分別考察乳化劑用量為0.60、0.75、0.90和1.05 g時(shí)對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響，結(jié)果見圖5。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)因素與水平表（表1），以載藥量（Y1）和包封率（Y2）為考察指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2～3。

以載藥量（Y1）和包封率（Y2）為考察指標(biāo)，在正交試驗(yàn)結(jié)果分析時(shí)使每個(gè)指標(biāo)盡可能達(dá)到最優(yōu)。采用綜合平衡法[13]的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，先對每個(gè)指標(biāo)分別進(jìn)行單指標(biāo)的直觀分析，得到每個(gè)指標(biāo)的影響因素主次順序和最佳水平組合：①以載藥量為考察指標(biāo)時(shí)，影響因素從大到小依次為交聯(lián)劑用量、替米考星用量、乳化劑用量、反應(yīng)時(shí)間，最佳制備工藝條件為A1B2C3D2（表2）。②以包封率為考察指標(biāo)時(shí)，影響因素從大到小依次為交聯(lián)劑用量、替米考星用量、乳化劑用量、反應(yīng)時(shí)間，最佳制備工藝條件為A1B2C3D2（表3）。

根據(jù)理論知識(shí)和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，交聯(lián)劑用量要適當(dāng)，當(dāng)交聯(lián)劑用量為1.00 g時(shí)，雖然載藥量和包封率較高，但通過掃描電鏡的觀測發(fā)現(xiàn)微球少，且大量粘連，因此選擇的交聯(lián)劑用量為0.95 g，即C2。

綜合考慮Y1和Y2 2個(gè)指標(biāo)后，確定各影響因素從大到小依次為交聯(lián)劑用量、替米考星用量、乳化劑用量、反應(yīng)時(shí)間;最佳制備工藝條件為A1B2C2D2，即替米考星0.02 g，交聯(lián)劑0.95 g，乳化劑0.75 g，反應(yīng)時(shí)間1.5 h，按照優(yōu)化工藝參數(shù)制得的替米考星淀粉微球的載藥量為1.63%，包封率為81.4%。

2.4 替米考星交聯(lián)淀粉微球的表面形態(tài)分析 由圖6可知，微球形貌較圓整規(guī)則，大小比較均一。微球表面粗糙多孔，無粘連。這說明反應(yīng)過程中交聯(lián)乳化效果較好，體系較為穩(wěn)定。

3 討論

（1）制備過程中應(yīng)注意集熱式恒溫加熱磁力攪拌器的攪拌速度。攪拌速度過小，水相易粘連成塊狀，交聯(lián)效果差;攪拌速度過大，油相易飛濺，影響反應(yīng)的進(jìn)行。因此，在反應(yīng)過程中需要適當(dāng)控制攪拌速度，且用錐形瓶作為反應(yīng)器，以減少油相的飛濺。

（2）采用適當(dāng)?shù)膬上嗉尤氲姆椒?。文獻(xiàn)中均采用水相加入油相的制備方法，但經(jīng)過多次預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于水相為可溶性淀粉溶液，較為黏稠，在制備過程中損失較大，因此該研究采用油相加入水相的方法，易于操作，減少了藥物損失，提高了包封率和載藥量。

（3）洗滌微球應(yīng)充分。用適量乙酸乙酯洗滌多次，再用適量無水乙醇洗滌多次;否則，抽濾后的微球粘成塊狀，不易干燥，且不易破壞，影響含量的測定。

4 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化替米考星淀粉微球的制備工藝，各影響因素從大到小依次為交聯(lián)劑用量、替米考星用量、乳化劑用量、反應(yīng)時(shí)間;最佳制備工藝條件如下：替米考星0.02 g，交聯(lián)劑0.95 g，乳化劑0.75 g，反應(yīng)時(shí)間1.5 h，按照此優(yōu)化工藝參數(shù)制得的替米考星淀粉微球載藥量為1.63%，包封率為81.4%;制得的微球形貌較為圓整規(guī)則，大小較為均一。該研究為替米考星劑型的改進(jìn)和創(chuàng)新提供了新思路，擴(kuò)大了替米考星的應(yīng)用范圍，也為獸藥新劑型和新技術(shù)的研究與發(fā)展提供了重要參考。

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