王興吉 王克芬 劉文龍 郭慶亮

摘要胰蛋白酶（Trypsin）作用于堿性氨基酸精氨酸及賴氨酸羧基所組成的肽鍵，被廣泛用于食品、醫(yī)藥和皮革等工業(yè)領(lǐng)域。該文研究高產(chǎn)誘變灰色鏈霉菌LD1810產(chǎn)胰蛋白酶（SGT）的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基，探討SGT的最佳發(fā)酵條件，為SGT的商業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。通過(guò)單因素試驗(yàn)和L9（34）正交試驗(yàn)確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分：葡萄糖 20 g/L，大豆粉 40 g/L，KH2PO4 2.5 g/L，CaCl2 1 g/L。最適發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度28 ℃，初始pH 8.0，300 mL 三角瓶的裝液量100 mL，搖床轉(zhuǎn)速 240 r/min。

關(guān)鍵詞灰色鏈霉菌;胰蛋白酶;培養(yǎng)基;發(fā)酵條件

中圖分類號(hào)S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2019）02-0007-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.003

胰蛋白酶（Trypsin，EC 3.4.4.4）是蛋白水解酶類的一種[1]，具備由天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸氨基酸殘基所組成的催化三聯(lián)體的典型特征。胰蛋白酶具有的2個(gè)重要特征可以將其與其他絲氨酸蛋白酶區(qū)分開(kāi)來(lái)：能專一性地把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前體，起活化作用[2]。另外，在堿性條件下胰蛋白酶具有較高的催化活力，所以是一種堿性蛋白酶。胰蛋白酶在醫(yī)藥[3-6]、食品[7]、皮革加工[8]、紡織和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[9]有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

通過(guò)鏈霉菌屬菌株產(chǎn)的胰蛋白酶主要有紅熱鏈球菌Streptomyces eryrhreus產(chǎn)胰蛋白酶（SET），弗氏鏈霉菌Strepromyces fradiae產(chǎn)胰蛋白酶（SFT）和灰色鏈霉菌Streptomyces? griseus產(chǎn)胰蛋白酶（SGT）。目前，微生物產(chǎn)胰蛋白酶仍處于研究階段，產(chǎn)酶效率不高，與商業(yè)化生產(chǎn)仍有差距。該研究探討高產(chǎn)胰蛋白酶的誘變灰色鏈霉菌菌株的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基，同時(shí)探尋SGT的最佳發(fā)酵條件，為SGT的商業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株

灰色鏈霉菌為山東隆科特酶制劑有限公司省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室誘變篩選保藏菌種（Streptomyces griseus），命名為L(zhǎng)D 1810。

1.2培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基;

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉40 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸鎂2 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L。

1.3培養(yǎng)基組成的確定

保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基其他組成不變，依次改變培養(yǎng)基的氮源、碳源和無(wú)機(jī)鹽，測(cè)定發(fā)酵液中胰蛋白酶活力。確定最佳氮源、碳源和無(wú)機(jī)鹽后，對(duì)氮源、碳源及無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以找出菌體發(fā)酵最好的優(yōu)化培養(yǎng)基，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

1.4產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的確定

試驗(yàn)分別從培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始 pH、搖瓶培養(yǎng)基裝液量和搖床轉(zhuǎn)速等方面進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定最佳培養(yǎng)條件。

1.4.1培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

分別設(shè)定發(fā)酵溫度為24、26、28 、30和 32 ℃，在豆粕40.0%、磷酸二氫鉀2.5%、氯化鈣1.0%、葡萄糖20.0%的培養(yǎng)基，pH 8.0，裝液量100 mL，240 r/min條件下發(fā)酵5 d后，取發(fā)酵液離心測(cè)定酶活力，考察不同溫度條件下發(fā)酵產(chǎn)酶的變化規(guī)律。

1.4.2初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶影響的研究。

分別取初始pH為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在豆粕40.0%、磷酸二氫鉀2.5%、氯化鈣1.0%、葡萄糖20.0%的培養(yǎng)基，28 ℃，裝液量100 mL，240 r/min條件下發(fā)酵5 d后，取發(fā)酵液離心測(cè)定酶活力，考察不同pH條件下發(fā)酵產(chǎn)酶的變化規(guī)律。

1.4.3裝液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶影響的研究。

裝液量分別選取50、75、100、125、150和200 mL，在豆粕40.0%、磷酸二氫鉀2.5%、氯化鈣1.0%、葡萄糖20.0%的培養(yǎng)基，28 ℃，pH 8.0，240 r/min條件下發(fā)酵5 d后，取發(fā)酵液離心測(cè)定酶活力，考察不同裝液量條件下發(fā)酵產(chǎn)酶的變化規(guī)律。

1.4.4轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

分別取轉(zhuǎn)速為100、150、200、240、260和300 r/min，在豆粕40.0%、磷酸二氫鉀2.5%、氯化鈣1.0%、葡萄糖20.0%的培養(yǎng)基，28 ℃，pH 8.0，裝液量100 mL條件下發(fā)酵5 d后，取發(fā)酵液離心測(cè)定酶活力，考察不同轉(zhuǎn)速條件下發(fā)酵產(chǎn)酶的變化規(guī)律。

1.5酶活測(cè)定方法

胰蛋白酶參照中國(guó)藥典方法[10]進(jìn)行測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵時(shí)間的確定

灰色鏈霉菌在搖瓶中培養(yǎng)7 d，每24 h 取樣測(cè)酶活。由圖1可知，灰色鏈霉菌發(fā)酵前5 d，胰蛋白酶酶活性迅速上升，酶活力持續(xù)增加，發(fā)酵5 d時(shí)酶活力最高達(dá)到81.5 U/mL。發(fā)酵5 d后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活有所下降，究其原因是發(fā)酵后期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，微生物衰老死亡，產(chǎn)酶能力下降。綜合發(fā)酵的變化情況，選取5 d作為發(fā)酵時(shí)間。

2.2灰色鏈霉菌產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.2.1碳源種類對(duì)灰色鏈霉菌產(chǎn)胰蛋白酶的影響。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加濃度為2%的不同碳源作為唯一碳源，發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果見(jiàn)圖2，結(jié)果表明，葡萄糖作為碳源時(shí)灰色鏈霉菌所產(chǎn)酶活最大，為85.4 U/mL，麥芽糖次之，菌種對(duì)這2種碳源利用效果較好，說(shuō)明菌體對(duì)麥芽糖和葡萄糖的利用最好。葡萄糖不僅能夠提供合成代謝所需的能量，也能在細(xì)胞分解代謝中提供小分子碳架，同時(shí)葡萄糖較為廉價(jià)，因而選擇葡萄糖作為碳源。

2.2.2氮源種類對(duì)灰色鏈霉菌產(chǎn)胰蛋白酶的影響。